Строение и классификация гликозаминогликанов. Биосинтез, локализация и функции протеогликанов. Состав протеогликанов в трансформированных клетках. D-глюкуронил С5-эпимераза. Выделение РНК фенольным методом. Проверка чистоты РНК на содержание примеси ДНК.
Аннотация к работе
Одной из таких молекул является декорин - лейцин-богатая молекула дерматансульфат протеогликана, состоящая из белкового кора и несущая на себе одну цепь дерматансульфата. Показано, что декорин подавляет клеточную пролиферацию, показаны механизмы его антимитотического действия - через усиление экспрессии р21 белка, супрессии циклина и подавлении активности циклин зависимых киназ. Добавление декорина в культуру опухолевых клеток приводило к возвращению опухолевых клеток к нормальному фенотипу, введение генноинженерных конструкций содержащих ген декорина в экспериментально растущую опухоль приводило к значительному замедлению роста опухоли, что позволило отнести декорин к перспективным антиопухолевым агентам. Известно, что ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфат протеогликанов (в том числе и декорина) является D-глюкуронил С5-эпимераза - фермент, который осуществляет модификацию углеродной цепи хондроитинсульфата в дерматансульфат. Основной проблемой в изучении данного вопроса является то, что ген D-глюкуронил С5-эпимеразы до сих пор не клонирован и ранее работы с этим геном не проводились.Молекулы гликозаминогликанов (ГАГ) представляют собой неразветвленные углеводные цепи с характерными повторяющимися дисахаридными единицами, которые включают в себя гексозамин (D-глюкозамин или D-галактозамин) и уроновую кислоту (D-глюкуроновую или L-идуроновую), присутствующую во всех ГАГ, за исключением кератансульфата, где она замещена остатками галактозы (рис.2). В зависимости от гексозамина, входящего в состав углеводной цепи гликозаминогликана, выделяют следующие основные классы гликозаминогликанов: гиалуроновая кислота (ГК), гепарансульфаты/гепарин (ГС/Ге), хондроитинсульфаты (ХС), дерматансульфаты (ДС), кератансульфаты (КС) (рис. Если в состав ГАГ входит глюкозамин, то углеводную цепь относят к классу ГС/ Ге, если в состав входит галактозамин, то углеводную цепь ГАГ относят к классу ГС/ ДС [1]. После завершения синтеза углеводной цепи происходит ее модификация - эпимеризация глюкуроновой кислоты, проводимая ферментом D-глюкуронил С5-эпимеразой (С5-EPI) и сульфатирование/деацетилирование, проводимое ферментом N-деацетилаза/сульфатаза. Показано, что в клетках практически всех исследованных опухолевых тканей происходит увеличение содержания протеогликанов по сравнению с нормальной тканью: в опухолевых клетках карциномы желудка происходит увеличение содержания ПГ по сравнению с нормальной тканью в два раза [26], в карциноме поджелудочной железы в 4 раза [27], в карциноме прямой кишки - в 2 раза [28].В работе были использованы следующие материалы и реактивы: этиловый спирт, фенол, хлорид калия, хлорид натрия, хлороформ, изопропиловый спирт, уксусная, соляная, кислоты - отечественного производства категории ОСЧ. Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовались праймеры, синтезированные в компании "Лаборатория Медиген", Новосибирск. К отобранной фазе добавляли равный объем смеси водонасыщенного фенола с хлороформом (1:1) (на 250мкл водной фазы 125мкл фенола и 125мкл хлороформа). Переносили гомогенат в чистую пробирку Eppendorf и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали 12,000 g в течение 10 мин.Поэтому нашей первой задачей было изучение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в ткани молочной железы человека, для решения которой нами был выбран метод ОТ-ПЦР. Экспрессиию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевой ткани смотрели методом ОТ-ПЦР, сравнивая ее с экспрессией гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной ткани (максимально удаленная от опухоли ткань молочной железы того же пациента). Согласно предварительной качественной оценке, у 10 пациенток из 30 экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли по сравнению с контролем увеличивалась, у 8 пациентов экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с контролем уменьшалась, у 11 пациенток не удалось детектировать D-глюкуронил С5-эпимеразу ни в контроле, ни в опухоли (Рис. Суть этого метода заключается в том, что в одну пробирку одновременно добавляли праймеры для гена D-глюкуронил С5-эпимеразы (эпимераза 329/1240) и гена GAPDH, чтобы оценить уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по отношению к экспрессии гена GAPDH (рис.21) Согласно предварительным оценкам у 7 пациентов из 20 в опухоли происходило увеличение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с контролем, у 5 - уменьшение экспрессии гена эпимеразы, причем у 3 пациентов из 5 происходило уменьшение экспрессии гена эпимеразы вплоть до полного исчезновения, у 8 пациентов из 20 экспрессия гена эпимеразы в опухоли значительно не изменялась по сравнению с контрольной тканью (рис.Проведен сравнительный анализ экспрессии этого гена в нормальной ткани молочной железы (от пациентов, не страдающих злокачественными новообразованиями), контрольной ткани (ткань молочной железы, максимально удаленная от опухоли) и опухоли молочной железы человека. Показано, что снижение экспрессии
Введение
На сегодняшний день одной из основных проблем клеточной биологии является изучение регуляции клеточной пролиферации. На данный момент открыто множество биологических молекул, которые участвуют в процессах злокачественной трансформации. Одной из таких молекул является декорин - лейцин-богатая молекула дерматансульфат протеогликана, состоящая из белкового кора и несущая на себе одну цепь дерматансульфата. В последние годы активно ведутся исследования декорина. Показано, что декорин подавляет клеточную пролиферацию, показаны механизмы его антимитотического действия - через усиление экспрессии р21 белка, супрессии циклина и подавлении активности циклин зависимых киназ.
Добавление декорина в культуру опухолевых клеток приводило к возвращению опухолевых клеток к нормальному фенотипу, введение генноинженерных конструкций содержащих ген декорина в экспериментально растущую опухоль приводило к значительному замедлению роста опухоли, что позволило отнести декорин к перспективным антиопухолевым агентам.
Известно, что в опухолевых клетках происходит снижение экспрессии и содержания декорина. Однако причина этого до сих пор остается неизвестной.
Нами было высказано предположение, что происходит изменение в процессе биосинтеза декорина. Известно, что ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфат протеогликанов (в том числе и декорина) является D-глюкуронил С5-эпимераза - фермент, который осуществляет модификацию углеродной цепи хондроитинсульфата в дерматансульфат. Возможно, что происходит нарушение экспрессии либо активности этого фермента, что приводит к нарушению структуры и состава протеогликанов в опухолевых клетках.
Основной проблемой в изучении данного вопроса является то, что ген D-глюкуронил С5-эпимеразы до сих пор не клонирован и ранее работы с этим геном не проводились. Однако после окончания секвенирования генома человека методом компьютерного анализа была обнаружена последовательность ДНК, гомологичная гену D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши. Это позволило начать нам начать работу по изучению экспрессии человеческого гомолога мышиной D-глюкуронил С5-эпимеразы и ее корреляции с экспрессией гена декорина в опухолевой ткани молочной железы человека.
Таким образом, целью данной работы являлось: установление взаимосвязи между экспрессией гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и гена декорина в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.
В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи: 1. Провести компьютерный анализ последовательности ДНК, гомологичной гену D-глюкуронил С5-эпимеразы животных и подобрать праймеры для человеческого гомолога мышиного гена D-глюкуронил С5-эпимеразы.
2. Оценить уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в клинических образцах нормальной ткани молочной железы человека.
3. Провести сравнительный анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека.
4. Определить уровень экспрессии гена декорина в тех же самых клинических образцах контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека.
5. Проверить наличие взаимосвязи исследованных параметров (экспрессию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и экспрессию гена декорина в опухоли) между собой и сопоставить с клиническими диагнозами пациентов.