Характеристика моноклональних антитіл, які здатні специфічно розпізнавати як ядерну, так і цитоплазматичну форми p70S6K. Аналіз екзогенного впливу епідермального фактору росту на клітини епітеліального походження in vitro при ендометрії у людини.
Аннотация к работе
Розуміння механізмів порушень функціонування клітини дає змогу використовувати більш точні та високоспецифічні підходи в діагностиці пухлин та лікуванні хворих. Велика увага приділяється дослідженню ролі мітогенних факторів при виникненні порушень у функціонуванні сигнальних систем клітини при різних патологічних процесах. Одним з субстратів MTOR кінази є p70S6 кіназа (p70S6K), активація якої впливає на регуляцію таких процесів в клітині, як індукований мітогенними факторами біосинтез білка, перехід клітини з фази G1 в S, фосфорилювання рибосомного білку S6 і, як наслідок, трансляція специфічної родини матричних РНК 5’ТОР, що кодують білки - компоненти апарату білкового синтезу. Вважається, що високий рівень експресії та активації p70S6K повязаний з залученням PI3K/MTOR/p70S6К-сигнального каскаду до регуляції проліферації пухлинних клітин (Inoki K. et al., 2003) та/або підсилення ангіогенезу пухлин шляхом індукції синтезу факторів росту ендотелію судин (El-Hashemite N. et al., 2003). Метою роботи було дослідження особливостей експресії гену p70S6K та фосфорилювання рибосомного білку S6 в злоякісно трансформованих клітинах епітеліального походження у відповідь на вплив екзогенного епідермального фактору росту, а також визначення експресії p70S6K в динаміці розвитку пухлинного процесу in vivo та особливостей експресії p70S6K та фосфорилювання рибосомного білку S6 в тканинах аденокарцином ендометрію людини.Нами було досліджено вплив ЕФР на рівень експресії генів ізоформ p70S6K в клітинних лініях, що містять різну кількість рецептора ЕФР (ЕФРР), а саме клітинах лінії А431 (107 молекул ЕФРР на клітину), М-HELA (106 молекул ЕФРР на клітину) та MCF7 (103 молекул ЕФРР на клітину). Слід зазначити, що за аналогічних умов не було виявлено різниці в експресії ізоформ p70S6K на рівні білку. Дослідження експресії p70S6K на рівні МРНК продемонструвало, що на початкових стадіях розвитку пухлини (для p70S6Кб-10-14 доба, для p70S6Кв - 10-18 доба) вміст МРНК обох ізоформ кінази в пухлині підвищувався, але надалі (18-22 доба) рівень експресії p70S6Кб та p70S6Кв в карциномі Герена майже не відрізнявся від такого в тканинах матки. Таким чином, кінетика експресії генів p70S6Кб та p70S6Кв в пухлинних тканинах була подібною, з тією різницею, що підвищений рівень експресії МРНК p70S6Кв в пухлинній тканині спостерігався більш тривалий час (до 18 діб). На 14 добу - в пухлині рівень експресії p70S6Кб був на 30% вищий ніж в тканинах матки, де цей показник теж підвищувався; на 18 добу рівень експресії p70S6Кб в пухлинній тканині мав тенденцію до зниження.Встановлено, що пухлинні клітини епітеліального походження характеризуються гіперекспресією ізоформ p70S6Ka та p70S6Кв, підвищеним рівнем фосфорилювання рибосомного S6 білку, прогресія пухлинного процесу супроводжується змінами в експресії та внутрішньоклітинній локалізації ізоформ p70S6K. Високий рівень експресії p70S6Ka в ендотеліальних клітинах судин пухлин ендометрію вказує на її залучення до процесів ангіогенезу пухлин. Дія ЕФР in vitro призводить до підвищення рівня фосфорилювання субстрату p70S6K рибосомного білку S6, динаміка якого є різною в клітинах А431, HELA та MCF7, що характеризуються різним рівнем експресії рецептора ЕФР.
Вывод
Встановлено, що пухлинні клітини епітеліального походження характеризуються гіперекспресією ізоформ p70S6Ka та p70S6Кв, підвищеним рівнем фосфорилювання рибосомного S6 білку, прогресія пухлинного процесу супроводжується змінами в експресії та внутрішньоклітинній локалізації ізоформ p70S6K. Високий рівень експресії p70S6Ka в ендотеліальних клітинах судин пухлин ендометрію вказує на її залучення до процесів ангіогенезу пухлин.
1. Отримано та охарактеризовано моноклональні антитіла до p70S6Ka, які здатні специфічно розпізнавати як ядерну, так і цитоплазматичну форми p70S6Ka та можуть застосовуватись в біохімічних та імуногістохімічних методах.
2. Встановлено, що наслідком екзогенного впливу ЕФР на клітини епітеліального походження in vitro є підвищення рівня експресії генів p70S6Ka та p70S6Кв. Рівень ЕФР-індукованої транскрипції p70S6Ka та p70S6Кв має пряму кореляцію з рівнем експресії рецептора ЕФР в досліджених лініях клітин.
3. Дія ЕФР in vitro призводить до підвищення рівня фосфорилювання субстрату p70S6K рибосомного білку S6, динаміка якого є різною в клітинах А431, HELA та MCF7, що характеризуються різним рівнем експресії рецептора ЕФР.
4. Зясовано, що підвищений рівень експресії p70S6Ka та p70S6Кв в пухлинній тканині карциноми Герена корелює з проліферацією пухлинних клітин та прогресією пухлинного процесу. Визначено, що найвищі показники експресії та ядерна локалізація обох ізоформ властиві раннім етапам розвитку пухлини, показано гіперекспресію p70S6Ka в клітинах судин пухлинної тканини карциноми Герена на початкових етапах розвитку пухлини.
5. Виявлено гіперекспресію p70S6Ka та p70S6Кв на рівні МРНК та білку у більшості зразків пухлин ендометрію людини, а також відмінності в локалізації та рівні фосфорилювання білку S6 в нормальній та пухлинній тканині.
6. Показано, що характерною для пухлинних клітин ендометрію людини є ядерна локалізація p70S6Ka та p70S6Кв.
7. Гіперекспресія p70S6Ka та високий рівень фосфорилювання рибосомного білку S6 в ендотеліальних клітинах судин пухлинної тканини ендометрію людини вказує на можливу участь p70S6Ka в процесах ангіогенезу пухлинної тканини.
Список литературы
Основні положення дисертації викладені у 9 наукових роботах, в тому числі в 3 статтях у провідних фахових виданнях та 6 тезах у збірках українських та зарубіжних конференцій.
Структура та обсяг дисертації
Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, розділу матеріали та методи досліджень, пяти розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків і списку використаної літератури. Основний зміст дисертації викладений на 117 сторінках машинописного тексту, містить 3 таблиці та 50 рисунків. Список використаної літератури включає 160 джерел, з них 4 кирилицею та 156 латиницею.
2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Отримання моноклональних антитіл (МКАТ) до p70S6Кб проводили шляхом злиття мієломних клітин лінії SP2/0 та спленоцитів мишей лінії Balb/c, що були імунізовані рекомбінантним білком p70S6Кб людини. Для імунізації використовували рекомбінантну цитоплазматичну форму p70S6Кб, КДНК якої була клонована в експресуючий бактеріальний вектор PET-23d. р70S6Кб експресували та напрацьовували в клітинах E.coli, штам BL21DE3, трансформованих експресуючим вектором PET-23d/6XHIS-р70S6Кб. Аналіз експресії генів p70S6Кб та p70S6Кв методами зворотної транскриптазної реакції та полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) проведено на РНК-матрицях злоякісно трансформованих клітин людини ліній A431, M-HELA та MCF7. Для культивування клітин використовували середовище RPMI-1640 (Gibco BRL, Великобританія) з додаванням 10% ембріональної сироватки крові великої рогатої худоби (ЕТС) (Gibco BRL, Великобританія). Для дослідження впливу ЕФР на експресію р70S6K та рівень фосфорилювання рибосомного білку S6 клітини вирощували на 24-лункових планшетах до 70% моношару, після чого змінювали середовище на безсироваткове на 24 год. Далі додавали до клітин ЕФР в концентрації 25 нг/мл для дослідження експресії p70S6Кб і p70S6Кв на рівні МРНК - на протязі 3 та 6 год., на рівні білка - на протязі 24 год. та для дослідження впливу ЕФР на фосфорилювання рибосомного білку S6 - на протязі 10, 20, 30, 60, 120, 180 хвилин та 24 годин.
В дослідах in vivo були використані 20 самок безпородних щурів розводки віварію ІЕПОР НАН України. В якості модельної пухлини використовували карциному Герена. Щеплення проводили на тваринах віком 1,5 місяців, вагою 140-180 г. Імплантували 2,5ґ106 клітин у 0,5 мл фізіологічного розчину підшкірно. Проводили забір зразків пухлин (периферичні ділянки пухлини, не уражені некрозами) та тканин матки. В якості контролю використовували здорових щурів (n=2). Забір зразків проводили на 10, 14, 18, 22 та 26 добу після перещеплення пухлини, в кожній часовій точці було 4 тварини. В дослідній групі відбір тварин проводився випадково. Дослідження проводили методами ЗТ-ПЛР, Вестерн-блот аналіза та імуногістохімії. Всі роботи з тваринами виконано згідно з правилами регіонального комітету по етиці.
В експериментах по дослідженню рівня експресії p70S6Ka та p70S6Kb на рівні МРНК та білку, а також рівня фосфорилювання рибосомного білку S6 в аденокарциномах ендометрію людини було використано хірургічно видалені зразки пухлин (аденокарцином низького, помірного та високого ступеня диференціювання; стадія Т1 - (n=45), стадія Т2 - (n=3), стадія Т3 - (n=2) та умовно нормальних тканин ендометрію, що оточували пухлину. Для вирішення поставлених задач було застосовано методи ЗТ-ПЛР, Вестерн-блот аналізу (зразки нормальних та пухлинних тканин 18 пацієнтів) та імуногістохімічні методи (зразки умовно нормальної тканини ендометрію 13 пацієнтів та зразки пухлин 50 пацієнтів). Зразки хірургічного матеріалу було отримано з відділення онкогінекології Інституту онкології АМНУ (зав. відділенням проф. Воробйова Л.І.) та морфологічної лабораторії “Біонтек” м. Дніпропетровськ. Пацієнти були проінформовані та дали згоду на використання хірургічного матеріалу в дослідницьких цілях. Класифікацію пухлин проводили згідно класифікації ВООЗ.
Для проведення реакції ЗТ-ПЛР загальну РНК виділяли методом кислофенольної екстракції з використанням набору реактивів “РИБО-золь-А” (АМПЛИСЕНС, Росія). Згідно послідовності МРНК даних генів було підібрано наступні олігонуклеотидні праймери: прямі - 5`-ttggggcatttacatcaaaaggg - для КДНК p70S6Кб та 5`- ggatcgccgccctttaccgca - для КДНК p70S6Кв. Зворотній олігонуклеотидний праймер 5`- cccag(a/g)aag(a/g)cctg(a/g)ttggcact - вироджений в деяких позиціях, що задовольняє умовам компліментарності для обох генів. Отримання комплементарної ДНК проводили згідно протокола виробника набору для синтезу КДНК (Fermentas, Литва). Для підвищення специфічності ампліфікації КДНК в процесі ПЛР та зменшення виходу неспецифічного продукту використовувався принцип “Hot Start”. Ампліфікацію проводили протягом 30 циклів, температурні режими ефективної ампліфікації складали 940С - 20 сек., 640С - 30 сек., 720С - 45 сек.
Для перевірки ефективності зворотної транскриптазної реакції проводили контрольну ПЛР з олігонуклеотидними затравками до гена гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази (G3PDH). Оптимальні умови для ампліфікації даного фрагмента наступні: 30 циклів при температурних режимах 950С - 20 с, 640С - 30 с, 720С - 45 с.
Імуногістохімічні дослідження проводили на парафінових зрізах методом непрямого виявлення антигену з використанням специфічних моноклональних та поліклональних антитіл. Для блокування активності ендогенної пероксидази зрізи тканин інкубували 30 хв. в розчині 0,3% H2O2. Для візуалізації реакції застосовували авідин-біотинову систему (Vectastain ABC Kit, Vecor Lab, США). Зрізи інкубували з розчином ABC 30 хв. при 20 ОС, відмивали, інкубували в розчині 0,003% H2O2 - 0,05% 3,3"- діамінбензидинтетрагідрохлорид (Sigma, США). Ядра клітин забарвлювали гематоксиліном Майєра. Виявлену цитоплазматичну локалізацію забарвлення оцінювали за наступною шкалою: 0 - відсутність забарвлення, 1 - слабке забарвлення, 2 - помірне забарвлення, 3 - інтенсивне забарвлення. Забарвлення в ядрах оцінювали: 0 - відсутність забарвлення, 1 - 1-20% позитивно забарвлених ядер, 2 - 20-50% позитивно забарвлених ядер, 3 - більш ніж 50% позитивно забарвлених ядер. Отримані дані підлягали непараметричному корелятивному аналізу з використанням коефіцієнту Спірмана.1. Lytvyn D.I., Dudchenko T.N., Filonenko V.V., Savinskaya L.A., Pogrebnoy P.V. Expression of p70S6 kinase in Guerins carcinoma cells upon tumor development // Experimental Oncology. - 2003. - V.25, №2. - С. 149-151. (Дисертант приймав участь в дослідженні експресії ізоформ p70S6K в динаміці розвитку карциноми Герена методом Вестерн-блот аналізу).
2. Lytvyn D.I., Dudchenko T.M., Lizogubov V.V., Usenko V.S., Nespryadko S.V., Vinnitskaya A.B., Vorobyova L.I., Palchevskiy S.S., Filonenko V.V., Pogrebnoy P.V. Expression of ?a- and ?b-isoforms of р70S6 kinase in human endometrial tumors // Experimental Oncology. - 2003. - V.25, №4, - 274-279. (Дисертант проводив дослідження методами Вестерн-блотинга та ЗТ-ПЛР, приймав участь в аналізі отриманих даних та написанні статті).
3. Lizogubov V.V., Lytvyn D.I., Dudchenko T.M., Lubchenko N.V., Pogrybniy P.V., Nespryadko S.V., Vinnitska A.B., Usenko V.S., Gout I.T., Filonenko V.V. Immunohistochemical analysis of S6K1 and S6K2 expression in endometrial adenocarcinomas // Experimental Oncology. - 2004.- V.26, №4, - 287-293. (Дисертант приймав участь в проведенні імуногістохімічних досліджень, аналізі результатів та написанні статті).
4. Gorbenko H.N., Litvin D.I., Savinskaya L.A., Filonenko V.V. Generation and characterization of monoclonal antibodies to P70 S6 kinase // Abstract book 6th John Humphrey advanced summer programme in immunology. Molecular basis of immune response. Pushchino. - Russia, 2002. - P.40.
5. Lytvyn D.I., Dudchenko T.M., Filonenko V.V., Savinska L.O., Pogribniy P.V. Expression of p70S6 kinase in tumor cells upon the development of Guerins carcinoma in vivo // Abstract book Conference for Young Scientists, PHD Students and Students on Molecular Biology and Genetics, Dedicated to the Golden Jubilee of the Double Helix of the DNA and 30 Anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine. - Kyiv, Ukraine, 2003. - C. 247.
6. Литвин. Д.І., Дудченко Т.М., Неспрядько С.В., Вінницька А.Б., Воробьйова Л.І., Лизогубов В.В., Усенко С.В., Погрібний П.В.// Імуногістохімічний аналіз експресії р70S6 кінази б в пухлинах ендометрію людини // Тези доповідей Установчого зїзду Українського товариства клітинної біології. - Львів, 2004. - С. 121.
7. Lytvyn D.I., Dudchenko T.M., Soldatkina M.A., Pogrybnoy P.V. EGF influence expression and enzyme activity of p70S6 kinase б and в isoforms // 5th Parnas Conference/The Ukranian Biochemical Journal. - 2005. - V. 77, № 2. - P. 127.
8. Литвин Д.И., Дудченко Т.Н., Неспрядько С.В., Винницькая А.Б., Воробьйова Л.И., Лизогубов В.В., Усенко С.В., Погребной П.В.// Экспрессия б и в-изоформ p70S6-киназы в опухолях эндометрия человека. Евро-Азиатский конгресс по акушерству и гинекологии. Санкт-Петербург, 2004. - С.97.
9. Литвин Д.И., Лизогубов В.В., Солдаткина М.А., Погребной П.В. Экспрессия и ферментативная активность изоформ p70S6 киназы в тканях аденокарцином эндометрия // Материалы международной школы-конференции молодых ученых Системная биология и биоинженерия. - Москва, 2005. - С.148-149.