Вивчення вмісту мРНК IFNа, методом полімеразної ланцюгової реакції у інтактній печінці щурів та печінці після часткової гепатектомії та лапаратомії. Виділення гепатоцитів та клітин Купфера. Оцінка вмісту білка IFNа у печінці, селезінці та сироватці крові.
Аннотация к работе
З того часу, як було відкрите явище регенерації печінки у гризунів, науковців цікавило питання, що змушує клітини печінки, які до операції перебували у стані спокою, почати ділитися. Проте внаслідок класичної операції видалення 2/3 печінки у щурів, клітини цього органу вже через 4 год готові до проходження клітинного циклу (Michalopoulos, 1990) і поділу, а через тиждень майже повністю відновлюється маса органу (Grisham, 1962). Дослідження також підтримано грантом Українського Науково-Технологічного Центру (УНТЦ) № 4381 за темою «Новітні технології у вивченні функціональної активності інтерферону альфа» (2007-2009 рр.), грантом Всесвітньої федерації вчених у сфері «Медицина» на тему «Інтерферон альфа та його роль у переході клітин від спокою до проліферації» (2006-2007 рр.), короткостроковими грантами ЮНЕСКО для проведення досліджень в Інституті онкології імені М. Метою роботи було вивчення експресії генів Ifna1(interferon alpha 1), рецептора до інтерферону Ifnar1 (interferon alpha, beta and omega receptor1), Ifnb1 (interferon beta 1) та гена Pkr (protein kinase R; синоніми - Eif2ak2, eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 2, білок p68) у печінці щурів, що регенерує. Виділити гепатоцити та клітини Купфера з інтактної печінки щурів та печінки після ЧГЕ та ЛАП; отримати напрацьовані або клоновані фрагменти КДНК Ifna1, Ifnar1, Pkr та рибосомного білка Rps12 (ribosomal protein 12) як стандарти для кількісної полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі (КПЛР-РЧ) для визначеня експресії генів Ifna1, Ifnar1, Pkr та Rps12 у цих клітинах після ЧГЕ та ЛАП.Гепатоцити та клітини Купфера виділяли за модифікованим методом Беррі та Френда (Berry, Friend, 1969) перфузією печінки розчином 0,05 % колагенази з подальшим розділенням та очищенням клітин у процесі диференційного центрифугування, доповненого додатковими обробками ферментами. Рівень індукції синтезу IFN? в печінці після ЧГЕ порівнювали з таким рівнем індукції після введення внутрішньочеревно полі(І)-полі(Ц) (330 мкг на щура), а також з рівнем IFN? в селезінці та сироватці крові. Через 0,5 год після ЧГЕ вміст IFN?/? у залишку печінки перевищує вміст у суцільній печінці до операції, зберігається на одному рівні щонайменше протягом 3 год та зменшується через 6 - 12 год. У селезінці, так само як і у печінці, через 0,5 год після ЧГЕ зростає вміст IFN?/? в усьому органі, проте він не досягає такого рівня як у печінці, а підвищення є швидкоминучим. Зважаючи на різнорідність клітинного складу печінки, наступні експерименти були присвячені визначенню експресії генів у гепатоцитах, що відповідають за основні біохімічні функції печінки, та клітинах Купфера, осілих макрофагах та продуцентах значної кількості цитокінів.Досліджено експресію генів, які кодують IFN?, першу субодиницю його рецептора IFNAR1 та протеїнкіназу Р (PKR) у печінці щурів після ЧГЕ та ЛАП, що спричиняють, відповідно, перехід клітин печінки від спокою до проліферації (регенераційні процеси) та неспецифічну реакцію (гостра фаза). Доведено, що печінка є потужним продуцентом IFN І типу в інтактних тварин, тварин після ЧГЕ та введення полі(І)-полі(Ц). Вперше зясовано, що у печінці після ЧГЕ підвищується експресія гена Ifna1 протягом пререплікативного періоду. Показано, що неспецифічна реакція печінки, викликана ЛАП супроводжується вираженим довготривалим зниженням експресії гена Ifna1, яке виявляється одночасно в клітинах Купфера та в гепатоцитах. Експресія генів, які кодують ?-інтерферон, його рецептор, протеїнкіназу R та рибонуклеазу L в інтактній та регенеруючій печінці щурів / М.М.Перепелюк, А.М.Слончак, Л.Я.Сазонова, О.С.Губар, О.П.Якунчикова, М.Ю.Оболенська // Наукові записки НАУКМА.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Вывод
Досліджено експресію генів, які кодують IFN?, першу субодиницю його рецептора IFNAR1 та протеїнкіназу Р (PKR) у печінці щурів після ЧГЕ та ЛАП, що спричиняють, відповідно, перехід клітин печінки від спокою до проліферації (регенераційні процеси) та неспецифічну реакцію (гостра фаза).
Встановлено, що активація синтезу IFN? після ЧГЕ здійснюється переважно клітинами печінки протягом пререплікативного періоду.
Доведено, що печінка є потужним продуцентом IFN І типу в інтактних тварин, тварин після ЧГЕ та введення полі(І)-полі(Ц).
Вперше зясовано, що у печінці після ЧГЕ підвищується експресія гена Ifna1 протягом пререплікативного періоду. У цьому процесі клітини Купфера активуються раніше гепатоцитів.
Показано, що неспецифічна реакція печінки, викликана ЛАП супроводжується вираженим довготривалим зниженням експресії гена Ifna1, яке виявляється одночасно в клітинах Купфера та в гепатоцитах.
Зясовано, що експресія генів Ifna1, Pkr та Ifnar1 та субклітинна локалізація білка Pkr має клітинно-специфічний характер.
Виявлено, що гепатоцити є мішенями IFN?, який продукують клітини Купфера. Підвищена експресія гена Ifna1 клітинами Купфера супроводжується підвищеною експресією генів Ifnar1 та Pkr у гепатоцитах.
Показано, що після ЧГЕ рівень експресії гена Ifnar1 у клітинах Купфера не змінюється, що запобігає активації в них синтезу білків IFN?, PKR та зумовлює короткотривалість дії IFN?. Показано, що у цитоплазмі гепатоцитів інтактних тварин та тварин після ЧГЕ і ЛАП білок PKR виявляється у 100% клітин. Вперше доведено, що у пререплікативний період поряд з активацією синтезу Pkr-специфічної РНК відбувається перерозподіл білка PKR між ядром і цитоплазмою з тимчасовим виявленням білка PKR тільки у цитоплазмі.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Перепелюк М.М. Методичні підходи до вивчення експресії інтерферону альфа в інтактній та регенеруючій печінці щурів / М.М.Перепелюк, А.М.Слончак, М.Ю.Оболенська // Вісник КНУ імені Шевченка. Серія Біологія. - Т.45 - 46. - 2005. - С.85 - 87. Особистий внесок здобувача - апробація двох методів виділення РНК - з CSCL та за методом Хомчинського, аналіз продукту.
Експресія генів, які кодують ?-інтерферон, його рецептор, протеїнкіназу R та рибонуклеазу L в інтактній та регенеруючій печінці щурів / М.М.Перепелюк, А.М.Слончак, Л.Я.Сазонова, О.С.Губар, О.П.Якунчикова, М.Ю.Оболенська // Наукові записки НАУКМА. Біологія та екологія.- 2005. -Т.43. - C. 25 - 33. Особистий внесок здобувача - планування експериментів, визначення змін експресії генів Ifna1, Ifnar1, Pkr та Rnasel методом ЗТ-ПЛР.
Вміст інтерферону ?/? в печінці щурів після часткової гепатектомії / М.М.Перепелюк, Д.Б.Федорченко, С.Л.Рибалко, М.Ю.Оболенська // Науковий вісник Чернівецького університету. - 2006. - Вип. 297: Біологія. - С.88 - 93. Особистий внесок здобувача - виділення РНК, ЗТ-ПЛР та аналіз ампліконів.
Експресія інтерферону ? в печінці щурів після часткової гепатектомії / М.М.Перепелюк, Д.Б.Федорченко, С.Л.Рибалко, М.Ю.Оболенська // Біополімери і клітина. - 2006. - Т.22, №4. - С.283 -290. Особистий внесок здобувача - визначення вмісту IFN? та IFN? в печінці після ЧГЕ та ЛАП методом ЗТ-ПЛР.
Інтерферон ? та протеїнкіназа Р в процесі відновлення печінки щурів після часткової гепатектомії / М.М.Перепелюк, А.В.Куклін, Я.В.Щерба, Б.Т.Токовенко, Н.В.Макогон, А.Гоглер, С.Шале, М.Ю.Оболенська // Biopolymers and cell. - 2009. - Т.25, №2. - С.145 - 149. Особистий внесок здобувача - визначення змін експресії білка PKR та його внутрішньоклітинної локалізації після ЧГЕ і ЛАП методами Вестерн-блот аналізу та імуногістохімії; написання основної частини статті.
Expression of IFN-a, its receptor, RNASE L and Protein kinase R in regenerating rat liver / M.M.Perepelyuk, A.M.Slonchak, D.B.Fedorchenko, L.Ya.Sazonova, O.S.Gubar, O.P.Yakunchikova, S.L.Rybalko, M.Yu.Obolenskaya // Український біохімічний журнал (спеціальний випуск). - 2005. - Vol. 77, №2. - 217. Особистий внесок здобувача - виділення РНК з тотальної печінки, ЗТ-ПЛР визначення Ifna1-, Ifnar1-, RNASEL-, Pkr- та Rps12-специфічних МРНК в інтактній печінці та печінці після ЧГЕ і ЛАП.
Interferon ?/? content in rat liver after partial hepatectomy / M.M.Perepelyuk, D.B.Fedorchenko, S.L.Rybalko, M.Yu.Obolenskaya // European Journal of Clinical Investigation. - March 2006. - Vol.36, Suppl.1. - P.11. Особистий внесок здобувача - визначення специфічних МРНК в інтактній та післяопераційній печінці.
Interferon alpha/beta in rat liver after partial hepatectomy as growth modulator of hepatocytes / M.M. Perepelyuk, D.B.Fedorchenko, S.L.Rybalko, M.Yu.Obolenskaya // European Journal of Cancer Suplements. - February 2006. - Vol.4, №1. - P. 60. Особистий внесок здобувача - визначення Ifna1-, Ifnb1- та Rps12-специфічної МРНК в інтактній печінці, печінці після ЧГЕ і ЛАП та розділених гепатоцитах та клітинах Купфера.
Експресія інтерферону ? в печінці щурів у відсутності вірусної інфекції / М.М.Перепелюк, Д.Б.Федорченко, С.Л.Рибалко, М.Ю.Оболенська // Молодь та поступ біології: Збірник тез Другої Міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів (21-24 березня 2006 року, м.Львів). - Львів, 2006. - С.345 - 346. Особистий внесок здобувача - визначення специфічних МРНК в інтактній та післяопераційній печінці.
Interferon alpha and its targets in intact and partially hepatoctemized rat liver / M.M.Perepelyuk, A.V.Kuklin, O.P.Jakunchikova, D.B.Fedorchenko, M.Yu.Obolenskaya // Матеріали ІІІ Міжнародної конференції молодих вчених «Розмаїття живого. Екологія. Адаптація. Еволюція» (15 - 18 травня 2007 року) - С.215. Особистий внесок здобувача - виділення РНК із зразків печінки після ЧГЕ та ЛАП та ЗТ-ПЛР аналіз.
Novel technologies in the study of IFN alpha activity / B.Tokovenko, A.Kuklin, M.Perepelyuk, M.Obolenskaya // Abstracts of the conference “XI Gliwice Scientific Meetings 2007” - November 2007 - P.46. Особистий внесок здобувача - виділення РНК, проведення Вестерн-блот аналізу та імуногістохімії.
Interferon-? and its targets in regenerating rat liver / M. Perepelyuk, A.Kuklin, O.Jakunchikova, M.Obolenskaya // Abstracts of the conference for young scientists, PHD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M. Vavilov. - 20 - 22 September 2007. - Kyiv, Ukraine. - P.69. Особистий внесок здобувача - визначення специфічних МРНК в інтактній та післяопераційній печінці, написання основного тексту тез.