Дослідження ролі генетичних факторів у розвитку патологічних процесів, що ведуть до загибелі кардіоміоцитів (шляхом некрозу, апоптозу та аутофагії), зумовлюють стійкість міокарда до гіпоксії та інших патогенних факторів при ішемії-реперфузії міокарда.
Аннотация к работе
Не дивлячись на інтенсивні дослідження, етіологія гострого інфаркту міокарда та механізмів, ініціюючих компенсаторні процеси при ішемії-реперфузії, лишаються недостатньо вивченими. З використанням сучасних молекулярно-біологічних методів було показано, що вже в перші 24 години в зоні інфаркту відбувається зміна в експресії більш ніж тисячі генів, продукти яких грають роль у транскрипції, запаленні, клітинній проліферації, білковому синтезі та ін. Спираючись на те, що однією з найважливіших ланок патологічного процесу ішемії-реперфузії в серці є загибель кардіоміоцитів, яка відбувається різними шляхами (запрограмованими - апоптоз, аутофагічна клітинна смерть; та незапрограмованим - некроз), перспективним є вивчення змін експресії тих генів, продукти яких є регуляторами різних видів клітинної смерті. Дослідити зміни експресії генів, продукти яких є ключовими факторами відповіді клітини на гіпоксичний стрес: HIF-3alpha - фактору, що індукується гіпоксією, та білків теплового шоку HSP70 та HSP90 при відтворенні аноксії-реоксигенації та ендогенної кардіопротекції в культурі ізольованих кардіоміоцитів та в тканині міокарду при моделюванні ішемії-реперфузії in vivo Методи дослідження: виділення та культивування кардіоміоцитів; визначення різних видів клітинної смерті із застосуванням флуоресцентних барвників; моделювання аноксії-реоксигенації та пізнього ішемічного пре-та посткондиціонування, а також пізнього фармакологічного прекондиціонування на первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура; моделювання ішемії-реперфузії in vivo; визначення розміру зони інфаркту за допомогою флуоресцентної мікроскопії, виділення РНК з клітин та тканин серця, зворотна транскрипція та полімеразна ланцюгова реакція, полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі.Аноксія-реоксигенація моделювалася шляхом подачі до клітин безкисневї газової суміші (5% СО2 та 95% Ar) протягом 30 хвилин із наступною заміною живильного середовища та культивуванням клітин за вихідних умов (5% СО2 та 95% атмосферного повітря) протягом 24 год (Р1) чи 60 хв (Р2). Клітини інкубувалися у присутності інгібітору у концентрації 100 НМ, який розчиняли у ДМСО та додавали до поживного середовища за 24 год до моделювання аноксії-реоксигенації протягом 30 хв та 60 хв відповідно. Кількісну оцінку експресії генів білків теплового шоку проводили використовуючи метод полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі із застосуванням отриманих після зворотньої транскрипції одноланцюгових ДНК, праймерів зазначеної вище послідовності, та стандартизували відносно експресії гену 18S, як ендогенного контролю. Отримані одноланцюгові ДНК використовували для кількісної оцінки експресії генів Bcl2, FRAP та HIF-3alpha із використанням полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі із застосуванням TAQMAN Gene Expression Assay 7500 Fast Real-time PCR System Custom № 443137. Було також втановлено, що за умов аноксії-реоксигенації відбувається потужна активація експресії білків теплового шоку; вперше було досліджено вплив аноксії-реоксигенації на експресію HIF-3alpha у кардіоміоцитах та втановлено пригнічення експресії цього фактору за даних умов.У дисертації наведені теоретичне узагальнення та нові дані про зміни експресії генів, що приймають участь в регуляції запрограмованих типів клітинної смерті (апоптозі, аутофагії), а також значення цих генетичних факторів в механізмах кардіопротекції. Визначені зміни експресії генів, які беруть участь в загибелі кардіоміоцитів шляхом некрозу, апоптозу та аутофагії при аноксії-реоксигенації неонатальних кардіоміоцитів в культурі, а також при розвитку явищ пре-та посткондиціонування. Доведено, що експресія генів HSP70, HSP90, Bcl2, FRAP та HIF-3alpha в культурі неонатальних кардіоміоцитів через 30 хв аноксії та 24 год реоксигенації змінюється різноспрямовано: спостерігається виражена індукція генів білків теплового шоку (рівень МРНК HSP70 зростає у 4.4. рази, а HSP90 - у 38 разів), в той час як експресія HIF-3alpha значно знижується, а рівень МРНК Bcl2 та FRAP залишається незмінним. Встановлено, що відтворення ішемії-реперфузії в дослідах in vivo також спричинювало вірогідне збільшення експресії генів теплового шоку (МРНК HSP70 зростав у 9 разів, МРНК HSP90 - в 1.6 рази), експресія генів HIF-3alpha та Bcl2 також збільшувалася у 2.5 рази та в 4.4 рази відповідно, тоді як експресія гену FRAP, так само як і в культурі кардіоміоцитів, не змінювалась. Цитопротективний ефект віддаленого фармакологічного прекондиціонування із застосуванням інгібітору протеасоми реалізується за рахунок попередження загибелі клітин шляхом апоптозу та некрозу (зменшення кількості апоптотичних та некротичних клітин у 1.5 рази та на 2 % відповідно), що супроводжується збільшенням експресії білку теплового шоку HSP70 у 2 рази.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Вывод
Сучасними роботами в галузі патофізіології та молекулярної біології доведено, що генетичні фактори можуть грати значну роль в патогенезі ішемічного пошкодження серця. У дисертації наведені теоретичне узагальнення та нові дані про зміни експресії генів, що приймають участь в регуляції запрограмованих типів клітинної смерті (апоптозі, аутофагії), а також значення цих генетичних факторів в механізмах кардіопротекції.
1. Визначені зміни експресії генів, які беруть участь в загибелі кардіоміоцитів шляхом некрозу, апоптозу та аутофагії при аноксії-реоксигенації неонатальних кардіоміоцитів в культурі, а також при розвитку явищ пре- та посткондиціонування. Одночасно досліджені механізми загибелі неонатальних клітин серця в культурі.
2. Доведено, що експресія генів HSP70, HSP90, Bcl2, FRAP та HIF-3alpha в культурі неонатальних кардіоміоцитів через 30 хв аноксії та 24 год реоксигенації змінюється різноспрямовано: спостерігається виражена індукція генів білків теплового шоку (рівень МРНК HSP70 зростає у 4.4. рази, а HSP90 - у 38 разів), в той час як експресія HIF-3alpha значно знижується, а рівень МРНК Bcl2 та FRAP залишається незмінним.
3. Встановлено, що відтворення ішемії-реперфузії в дослідах in vivo також спричинювало вірогідне збільшення експресії генів теплового шоку (МРНК HSP70 зростав у 9 разів, МРНК HSP90 - в 1.6 рази), експресія генів HIF-3alpha та Bcl2 також збільшувалася у 2.5 рази та в 4.4 рази відповідно, тоді як експресія гену FRAP, так само як і в культурі кардіоміоцитів, не змінювалась.
4. Вперше розроблено методику пізнього ішемічного та фармакологічного пре- та посткондиціонування неонатальних кардіоміоцитів в культурі. Цитопротективний ефект віддаленого фармакологічного прекондиціонування із застосуванням інгібітору протеасоми реалізується за рахунок попередження загибелі клітин шляхом апоптозу та некрозу (зменшення кількості апоптотичних та некротичних клітин у 1.5 рази та на 2 % відповідно), що супроводжується збільшенням експресії білку теплового шоку HSP70 у 2 рази.
5. Вперше показані суттєві відмінності в механізмах кардіопротекції при пізньому пре- та посткондиціонуванні. Цитопротективний ефект пізнього ішемічного прекондиціонування реалізується за рахунок попередження апоптотичної загибелі кардіоміоцитів (зменшення апоптотичної популяції у 1.4 рази) в культурі при першому епізоді аноксії-реоксигенації і при повторному епізоді за рахунок зменшення кількості некротичних клітин (на 6 %). В той же час ішемічне посткондиціонування у віддаленому періоді (через 24 години) не виявляє цитопротективної дії, тобто не захищає культуру кардіоміоцитів від повторної дії аноксії-реоксигенації.
6. Встановлено, що на відміну від ішемічного прекондиціонування, при посткондиціонуванні, яке не спричинювало захисного ефекту, спостерігається відміна індукованої аноксією-реоксигенацією гіперекспресії білків теплового шоку та підвищення експресії гену Bcl2.
7. Показано зворотний кореляційний звязок між інтенсивністю експресії гену HSP70 та розміром некротичної ділянки при ішемії-реперфузії міокарда in vivo у щурів: чим більша була експресія гену HSP70, тим меньшим був розмір некротичної ділянки (r = -0.74, P < 0.05). Аналогічний, але менш виражений негативний звязок спостерігався між експресією гену HSP90 та розміром ішемічного ураження міокарду.
8. Отримані дані розширюють уявлення про генетичні механізми ішемічного ушкодження міокарда та адаптаційні зміни експресії генів (в першу чергу, білків теплового шоку) та створюють підгрунтя для розробки нових методів кардіопротекції, зокрема із застосуванням інгібіторів протеасоми.
Список литературы
1. Повторна аноксія-реоксигенація культивованих неонатальних кардіоміоцитів не спричинює апоптотичну клітинну смерть / О.В. Сурова, В.Є. Досенко, В.С. Нагібін, Л.В. Тумановська, О.О. Мойбенко // Фізіологічний журнал. - 2009. - № 1. - С. 19 - 26 (Дисертант самостійно провів експериментальні дослідження та статистичну обробку отриманих результатів дослідження).
2. Effects of late postconditioning on gene expression and cell death in neonatal rat cardiomyocyte cultures / O. V. Surovaya, V. E. Dosenko, V. S. Nagibin, L. Tumanovskaya, A. Moibenko // Pathophysiology. - 2009. - Vol. 16, № 1 - P. 47 - 52 (Дисертант самостійно зробив огляд літератури, експериментальні дослідження та підбір методик).
3. Effect of low dose of proteasome inhibitor on cell death and gene expression in neonatal rat cardiomyocyte cultures exposed to anoxia-reoxygenation / Olga V. Surova, Vasyl S. Nagibin, Lesya V. Tumanovskaya, Victor E Dosenko, Alexey A Moibenko // Experimental and Clinical Cardiology. - 2009. - Vol. 14, № 2 - P. 57 - 61 (Дисертант самостійно провів експериментальні дослідження та здійснив статистичну обробку отриманих даних).
4. Заглушення гена ALOX5 із застосуванням малих інтерферуючих РНК запобігає некротичній загибелі неонатальних кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації/ О.О. Лісовий, В.С. Нагібін, О.В. Сурова, Л.В. Тумановська, В.Є. Досенко, О.О. Мойбенко // Фізіологічний журнал. - 2009. - № 3. - С. 37 - 44 (Дисертант самостійно зробив підбір методик та статистичну обробку отриманих даних).
5. O. Surova, V. Dosenko, A. Moybenko. Investigation of cardioprotective genes expression in cardiac cells under anoxia-reoxygenation and late postconditioning: Abstracts of XXVIII European Section Meeting of the International Society for Heart Research, 28 - 31 May 2008, Athens. - 2008. - P. 739.
6. L. Tumanovska, V. Nagibin, V. Dosenko, O. Surova, O. Moibenko. Changes of isolated cardiomyocytes ultrastructure at modeling of endoplasmic reticulum stress: Abstracts of 8th Meeting of France - New EU Members 16th JMRC Symposium „New frontieries in cardiovascular research”, 5 - 7 June 2008, Krakow. - 2008. - P. 69.
7. D. Pashevin, V. Dosenko, Y. Byts, O. Surovaya, A. Moibenko. Changes of proteasomal activity in heart tissue, aorta and leukocytes of blood in cholesterol-induced atherosclerosis modelling: Abstracts of Russian-Norwegian scientific symposium “Defence of myocardium: molecular, pathological and clinical aspects”, 12 - 13 May 2008, Saint-Petersburg. - 2008. - P. 24 - 25.
8. O. Surovaya, Viktor. Dosenko, V. Nagibin, A. Moybenko. Effect of proteasomal inhibitor low dose on cell death and genes expression in isolated neonatal cardiomyocytes culture: Abstracts of 16th Euroconference on Apoptosis - 5th Swiss Conference on Apoptosis, 6 -9 September 2008, Bern. - 2008. - P.158.
9. Surovaya O. V. Changes of MRNA expression of endogenous cardioprotection genes in myocardial tissue at ischemia-reperfusion modeling in vivo / O. V. Surovaya // Ukrainian Scientific Medical Youth Journal. - 2008. - № 3. - P. 153 - 154.
10. О. В. Сурова, В. С. Нагібін. Інгібітори протеасоми - тригери раннього та пізнього пре кондиціонування: зб. тез V Міжнародній науковій конференції "Молодь та поступ біології", 12-15 травня 2009 р., Львів. Т. 1. - 2009. - С. 279 - 280.