Виявлення основних шляхів збільшення внутрішньоклітинної концентрації кальцію у сенсорних нейронах через потенціал керовані Са2 канали. Попередження збільшення [Ca2 ]вн викликаного гіпоксією методом аплікації ніфедіпіну (специфічного блокатору).
Аннотация к работе
В популяції DRG нейронів виділяють два типи клітин: малі нейрони (С тип) та великі нейрони (А тип). До перших належать нейрони, що проводять ноцицептивну (больову) інформацію, до других - нейрони, що проводять тактильну, температурну, пропріоцептивну та інші типи сенсорної інформації. Таке порушення може бути також повязане із зміною у функціонуванні задньокорінцевих гангліїв (нейронів С типу) та порушенням у них кальцієвого гомеостазу. Таке збільшення може призводити до змін у метаболізмі клітин, що у свою чергу може впливати на кальцієву сигналізацію при різних впливах на клітину, зокрема при зміні нормоксичного оточуючого середовища на гіпоксиче. Вперше було показано, що гіпоксія викликає відносно більший ефект у нейронах С типу (ноцицептивні), ніж у нейронах типу А (пропріоцептивні), причому збільшення концентрації кальцію виявляється більш помітним у центрі клітини порівняно з периферією в обох типах клітин.Виділені спинномозкові ганглії переносилися у розчин Tyrode, що містив ферменти колагеназу (тип ІА, Sigma, США) в концентрації 0.5 мг/мл та протеазу (тип XIV, Sigma, США) в концентрації 1 мг/мл, в якому витримувалися на протязі 25-30 хвилин при температурі 37 °С. Гіпоксичний ефект вираховувався відношенням [Ca2 ]вн через 3 хвилини після початку гіпоксії до базального рівня кальцію окремо для кожної клітини. Однак у деяких випадках ефект був незворотним (якщо клітина знаходилася у гіпоксичному стані на протязі 4 або більше хвилин) - незважаючи на вихід із гіпоксії, цитозольний вміст Ca2 продовжував підвищуватися, і незабаром наставала загибель клітини. Найпершим методичним підходом для зясування первинного джерела іонів Ca2 , що наповнюють клітину за гіпоксичних умов, було проведення експериментів при відсутності у зовнішньоклітинному просторі іонів кальцію. Для дослідження можливої участі активного транспорту Ca2 через мембрану у ефекті, що спостерігається при гіпоксії, було проведено експерименти в умовах блокування роботі Са2 -АТФАЗИ додаванням 30 ММ Cd2 у зовнішньоклітинний розчин.За допомогою флуоресцентного методу з використанням зонду Fura-2 було показано, що зменшення парціального тиску кисню у зовнішньоклітинному середовищі гостроізольованих сенсорних нейронів щурів до значень 25?35 мм рт.ст. спричиняє збільшення внутрішньоклітинної концентрації вільних іонів кальцію у всіх типах клітин (на 80 % та 120 % у великих та малих нейронах відповідно). Підвищення внутрішньоклітинної концентрації кальцію при гіпоксичному впливі є зворотним процесом, якщо час дії гіпоксії не перевищує 3.5?4 хвилини. Під час гіпоксії відбувається робота Na -Са2 -обмінника плазматичної мембрани у зворотному режимі, а також Na -залежне витікання кальцію із мітохондрій через Na -Ca2 обмінник внаслідок можливої активації натрієвих каналів та збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів Na . При гіпоксії відбувається інактивації Са2 -АТФАЗ плазматичної мембрани та ендоплазматичного ретикулуму, що веде до певного пригнічення накопичення ним кальцію. При хворобі на цукровий діабет та гіперглікемії, яка є однією з ознак захворювання, ефект гіпоксії на гостроізольовані сенсорні нейрони хворих тварин виявляється значно меншим у порівнянні з контролем, що може пояснюватися зменшенням потенціалу мітохондріальної мембрани та відповідним послаблення поглинання ним кальцію.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Вывод
1. За допомогою флуоресцентного методу з використанням зонду Fura-2 було показано, що зменшення парціального тиску кисню у зовнішньоклітинному середовищі гостроізольованих сенсорних нейронів щурів до значень 25?35 мм рт.ст. спричиняє збільшення внутрішньоклітинної концентрації вільних іонів кальцію у всіх типах клітин (на 80 % та 120 % у великих та малих нейронах відповідно).
2. Гіпоксичний ефект є більш вираженим у центрі нейронів у порівнянні з примембранним простором, що може бути повязано із просторовим розташуванням внутрішньоклітинних органел.
3. Підвищення внутрішньоклітинної концентрації кальцію при гіпоксичному впливі є зворотним процесом, якщо час дії гіпоксії не перевищує 3.5?4 хвилини.
4. Основним шляхом входу кальцію з позамембранного простору всередину нейронів є потенціалкеровані кальцієві канали L-типу. Пригнічення їх специфічним блокатором ніфедипіном майже повністю попереджує збільшення [Ca2 ]вн, викликане гіпоксією.
5. Під час гіпоксії відбувається робота Na -Са2 -обмінника плазматичної мембрани у зворотному режимі, а також Na -залежне витікання кальцію із мітохондрій через Na -Ca2 обмінник внаслідок можливої активації натрієвих каналів та збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів Na .
6. Додатково витікання кальцію із мітохондрій відбувається за рахунок можливого зменшення значення потенціалу на їх внутрішній мембрані та, відповідно, неможливості підтримання високого градієнту іонів Са2 між мітохондріями та цитозолем.
7. При гіпоксії відбувається інактивації Са2 -АТФАЗ плазматичної мембрани та ендоплазматичного ретикулуму, що веде до певного пригнічення накопичення ним кальцію.
8. Незначне збільшення [Ca2 ]вн можливе також завдяки Са2 -індукованому витіканню кальцію із ендоплазматичного ретикулуму, першопричиною якого є вхід кальцію із позаклітинного простору.
9. При хворобі на цукровий діабет та гіперглікемії, яка є однією з ознак захворювання, ефект гіпоксії на гостроізольовані сенсорні нейрони хворих тварин виявляється значно меншим у порівнянні з контролем, що може пояснюватися зменшенням потенціалу мітохондріальної мембрани та відповідним послаблення поглинання ним кальцію.
10. Основним чинником, що веде до загибелі клітини під час гіпоксичного впливу, може бути перевантаження мітохондрій кальцієм, внаслідок чого виникають дисфункції в роботі мітохондрій з подальшим їх руйнуванням.
ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗДОБУВАЧА ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Lukyanetz E.A., Stanika R.I., Koval L.M., Kostyuk P.O. 2003. Intracellular mechanisms of hypoxia-induced calcium increase in rat sensory neurons, Arch.Biochem.Biophys, 410(2), p.212-221.
Станіка Р.І., Костюк П.Г., Лукянець О.О. Клітинні механізми змін концентрації кальцію в сенсорних нейронах щурів при гіпоксичному впливі. Нейрофізіологія. Т.36, №1, 2004, С. 88-89.
Лукянець О.О., Станіка Р.І., Коваль Л.М., Яворська О.М., Костюк П.Г. Дослідження механізмів коливань внутрішньоклітинного кальцію у хром афінних клітинах щура. Клін. та експерим. патол. Т ІІІ, №2, Ч.2, 2004, С. 94-96.
Тези доповідей.
1. Stanika R.I., Kostyuk P.O., Lukyanetz E.A. Changes of intracellular calcium concentration in DRG neurons induced by hypoxia. Bogomoletz-Nencki Meeting,. Sulejow, 2001, P21.
2. Станіка Р.І., Костюк П.Г., Лукянець О.О. 2002. Вивчення впливу гіпоксії на кальцієвий гомеостаз в сенсорних нейронах щурів. Фізіол. журн. Т.48, №2, 2002, С. 15-16.