Дослідження властивостей генноінженерних білків – потенційних компонентів вакцин - Дипломная работа

Під словом «переможені» маються на увазі ті інфекції, проти яких створені високоефективні вакцини. Водночас, використовувані у повсякденній практиці вакцини, проти таких інфекцій - це малоконтрольована сверхкомплексна суміш з величезною кількістю баластних, у тому числі високотоксичних, забруднюючих компонентів з мікробних клітин, живильного середовища і клітин еукаріот, на яких вирощуються віруси. Отже, сучасна генна інженерія стоїть перед проблемою оптимізації штучних вакцин, їх нешкідливості та створенні єдиного багатокомпонентного препарату. Найвищого ступеня актуальності проблема штучних вакцин досягає в області створення ефективних препаратів проти ще непереможених інфекцій, серед яких однією з найбільш важливих вважається гепатит С. Складність розробки вакцини полягає у високій гетерогенності ВГС і здатності вірусу уникати імунної відповіді господаря.В основі цих досягнень лежать універсальність генетичного коду, можливість отримувати в ізольованому вигляді фрагменти генів і нуклеїнових кислот, синтезувати ex vivo фрагменти нуклеїнових кислот і обєднувати їх в єдине ціле [7]. Таким чином, зміна спадкових властивостей організму за допомогою генної інженерії зводиться до конструювання з різних фрагментів нового генетичного матеріалу, введення цього матеріалу в реципіентний організм, створення умов для його функціонування і стабільного спадкування [7]. Можлива зворотня ситуація - штучне аттенуювання, коли з генома бактерії або вірусу видаляють фрагменти ДНК, що визначають їх вірулентність і патогенність [2,3]. При збереженні протективних властивостей штучно атенуйовані бактерії і віруси можуть бути вакцинними препаратами або слугувати основою для отримання рекомбінантних вакцин. Генно-інженерні рекомбінантні конструкції, з одного боку, самі можуть бути досить ефективними вакцинами і, з іншого боку, створення таких конструкцій є етапом для побудови вектора і отримання живої атенуйованої вакцини.Цей факт може пояснити нинішні особливості глобального поширення генотипів і підтипів: 1а - поширений в основному в Північній і Південній Америці, а також в Австралії; Результати клонування і повного секвенування РНК ВГС, а також фізико-хімічні характеристики вірусу дозволили віднести ВГС до родини флавівірусів, виділивши в окремий рід Гепацивірусів. Порівняльний аналіз РНК ВГС з геномами інших вірусів, які входять у вказану родину, виявив схожість з фрагментами геномів вірусів Денге другого типу і вірусу плямистості гвоздики (група каріновірусів). Гени, що кодують структурні білки, розташовані у 5"-області геному вірусу, а неструктурні - у 3"-області. Вважається, що ця зона контролює синтез чотирьох білків: - Кор-білка - негліколізованого гідрофільного протеїда (р 19), який вважається нуклеокапсидним білком;Виявлено, що він може існувати як у повнорозмірній формі (відомій як р21 і містить 191 амінокислотний залишок), так і у вкороченій з С-кінця. Білки, що мають довжину не менш 174 амінокислотних залишків, локалізовані в цитоплазмі, а коротші виявляються в ядрі. Нещодавно показано, що кор-білок здатний модулювати внутрішньоклітинну дію ?-лімфотоксина, взаємодіючи з цитоплазматичної частиною його рецептора [55]. Відмітна структурна особливість оболонкових білків - наявність ділянок з високою частотою заміни амінокислотних залишків, які називаються варіабельними і гіперваріабельними зонами [56]. У Е2 знаходяться дві найбільш мінливі області вірусного поліпептида: HVR1 (27 амінокислотних залишків) і HVR2 (7 амінокислотних залишків), які локалізовані в N-кінцевій частині Е2.NS2-білок утворюється при аутокаталітичному розщепленні протеазою NS2/NS3. Активна область цієї протеази містить С-кінець NS2 і N-кінець NS3. Ніяких інших протеолітичних процесінгових функцій у цієї протеази, не знайдено. NS3 білок володіє декількома каталітичними функціями. Перший білок виконує роль кофактора серинової протеази.Фрагменти ДНК для вбудовування у вектор можна отримати безпосередньо з хромосомної ДНК, розщепивши її рестриктазами або зруйнувавши випадковим чином (наприклад, за допомогою ультразвуку) на сегменти з приблизно однаковою довжиною. Виділення генів за допомогою «вирізання» з генома, як правило, складається з чотирьох етапів: 1) отримання клонотеки фрагментів геному; Як правило, разом з геном залишаються фланкуючі його зайві нуклеотидні послідовності, що заважає подальшому використанню цього гена, або ж рестріктази відрізають частину гена, роблячи його функціонально неповноцінним. Найбільш поширеним є шлях отримання генів через синтез ДНК-копій (КДНК) інформаційних або будь-яких інших (в оптимальному випадку - індивідуальних) РНК шляхом їх зворотної транскрипції [23]. В одному з варіантів виділення МРНК з інфікованих клітин проводять безпосередньо із лізованих клітин (лізис здійснюють у денатуруючих середовищах з метою запобігання руйнівної дії нуклеаз на МРНК) з наступною екстракцією фенолом і хлороформом або центрифугуванням лізату через подушку 5,7M CSCL (для звільнення від клітинних ДНК) і заключною афінною хром

Зміст

Вступ

1. Генно-інженерні вакцини

2. Характеристика вірусу гепатиту С

2.1 Загальні відомості

2.2 Кор-білок та ініші оболонкові білки ВГС

2.3 Неструктурні білки

3. Методи отримання генноінженерних продуктів ВГС

3.1 Отримання відповідного фрагменту нуклеїнової кислоти

3.2 Трансформація клітин E. coli плазмідними векторами

4. Експериментальна частина. Матеріали та методи досліджень

4.1 Характеристика обєкту досліджень

4.2 Приготування поживних середовищ

4.3 Отримання компетентної культури E. coli штамів codon , PRARE2, PRPTGRO, PRPTKJG

4.4 Трансформація компетентних клітин E. coli codon , PRARE2, PRPTGRO, PRPTKJG плазмідою PET15b core та індукція експресії цільового рекомбінантного Кор-білка

4.5 Проведення електрофорезу

4.6 Отримання біомаси модифікованих культур

4.7 Отримання рекомбінантного Кор-білка

4.8 Проведення імуноферментного аналізу

5. Результати та їх обговорення

5.1 Створення штамів та перевірка активності синтезу

5.2 Результати очищення рекомбінантного Кор-білка ВГС

5.3 Результати імуноферментного аналізу

Висновки

Перелік посилань