ДНК-маркери у вивченні взаємовідносин між вірусом ядерного поліедрозу та його хазяїном непарним шовкопрядом - Автореферат

Використання ДНК-маркерів у вивченні взаємовідносин між вірусом ядерного поліедрозу та його хазяїном непарним шовкопрядом (Lymantria dispar) допомагають дослідити основні процеси, що відбуваються в їхньому життєвому циклі та використати ці знання у вирішенні теоретичних проблем і практичних завдань. ДНК-маркування впливу існуючих вірусних препаратів на комаху і пошук генетичних маркерів стійкості і чутливості до вірусу розширює знання щодо особливостей взаємовідносин в системі паразит-хазяїн та сприяє підвищенню ефективності захисту рослин. Дисертаційна робота виконана в рамках міжкафедральних науково-дослідних тем Таврійського національного університету: "Екологічні аспекти вивчення тваринного і рослинного світу степового і передгірського Криму" (2001-2005) (номер державної реєстрації 0101U005236) і "Еколого-генетичні аспекти вивчення біоценозів степового і передгірського Криму" (2006-2010) (номер державної реєстрації 0106U003978), а також тем, які фінансувалися Міністерством освіти і науки України: "Взаємодія популяцій непарного шовкопряда з патогенними мікроорганізмами: генетичні маркери вірулентності і стійкості" (2002-2004) (номер державної реєстрації 0102U001403) і "Теоретичні обгрунтовування оптимізації лісозахисних заходів у дібровах Криму: безпестицидний захист" (2005-2007) (номер державної реєстрації 0105U00222). Основна мета дослідження - знайти генетичні маркери трансоваріальної передачі вірусу, дослідити вплив фрагментів ДНК вірусу ядерного поліедрозу і вірусного препарату на гусениць непарного шовкопряда та виявити ДНК-маркери чутливості та стійкості комахи до вірусу. Вивчення ДНК вірусу і непарного шовкопряда здійснювалось за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР, PCR) з використанням методики довільно ампліфікованої поліморфної ДНК (ДАПД, RAPD) і PCR-аналізу із специфічними праймерами.Показано можливість використання біопрепаратів на основі ДНК-фрагментів вірусу (ДНК-інсектицидів) для боротьби з листогризучими комахами, зокрема з непарним шовкопрядом. Обєктами дослідження були непарний шовкопряд, личинки D. melanogaster, B. thuringiensis і вірус ядерного поліедрозу непарного шовкопряда. Вплив ДНК-фрагментів вірусу на життєздатність личинок непарного шовкопряда та D. melanogaster вивчали із застосуванням ділянки гену-інгібітору апоптозу вірусу (GENEID:1488470). Фрагменти ДНК вірусу довжиною приблизно 210, 290 та 350 п.н. були використані для доказу трансоваріальної передачі вірусу. Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда, що знаходиться в гусеницях I-го личинкового віку (I покоління): 2, 4 - присутність продуктів ампліфікації ДНК вірусу; 1, 3 - відсутність продуктів ампліфікації ДНК вірусу; 5 - продукти ампліфікації ДНК вірусу, виділеної з вірусного препарату з Китаю; 6 - маркер молекулярних мас ДНК від 200 до 1000 п.н. з кроком в 100 п.н.ДНК-фрагменти маркують взаємовідносини між вірусом ядерного поліедрозу та його хазяїном непарним шовкопрядом. Вперше за допомогою ДНК-маркерів доведено трансоваріальну передачу вірусу, встановлено інсектицидну дію його коротких ДНК-фрагментів, отримано 4 маркери стійкості та 2 маркера чутливості комахи до паразита. Використання методу RAPD-PCR з праймером OPA-08 дозволило отримати RAPD-маркери (зони 01, 02, 03 RAPD-спектру) наявності ДНК вірусу ядерного поліедрозу в непарному шовкопряді. Під час розвитку комахи на стадії яйця знижується рівень вірусоносійства серед особин непарного шовкопряда: встановлено достовірне зниження частот генотипів вірусу з RAPD-алелями довжиною приблизно 350, 290 та 210 п.н. Методом PCR-аналізу зі специфічними праймерами в імаго внутрішнього паразита яєць непарного шовкопряда Anastatus japonicus та в яйцях шовкопряда двох генерацій однієї лінії були знайдені STS-маркери вірусної ДНК довжиною 317 та 524 п.н.

Основний зміст роботи

ДНК-фрагменти маркують взаємовідносини між вірусом ядерного поліедрозу та його хазяїном непарним шовкопрядом. Вперше за допомогою ДНК-маркерів доведено трансоваріальну передачу вірусу, встановлено інсектицидну дію його коротких ДНК-фрагментів, отримано 4 маркери стійкості та 2 маркера чутливості комахи до паразита.

1. Використання методу RAPD-PCR з праймером OPA-08 дозволило отримати RAPD-маркери (зони 01, 02, 03 RAPD-спектру) наявності ДНК вірусу ядерного поліедрозу в непарному шовкопряді.

2. Під час розвитку комахи на стадії яйця знижується рівень вірусоносійства серед особин непарного шовкопряда: встановлено достовірне зниження частот генотипів вірусу з RAPD-алелями довжиною приблизно 350, 290 та 210 п.н. (P < 0,05). Це свідчить про виживання в яйцях непарного шовкопряда певних генотипів вірусу залежно від захисних сил організму окремої комахи.

3. Генотипи вірусів з RAPD-алелем довжиною приблизно 350 п.н. (зона 01 RAPD-спектру) переважно передаються через внутрішній вміст яйця комахи (P < 0,01).

4. Методом PCR-аналізу зі специфічними праймерами в імаго внутрішнього паразита яєць непарного шовкопряда Anastatus japonicus та в яйцях шовкопряда двох генерацій однієї лінії були знайдені STS-маркери вірусної ДНК довжиною 317 та 524 п.н. Вони співпадають за довжиною із теоретично розрахованими на основі секвенованої послідовності фрагментів геному вірусу і свідчать про трансоваріальну передачу вірусу.

5. Наявність у яєць непарного шовкопряда маркерів ДНК вірусу ядерного поліедрозу свідчить про трансоваріальну передачу патогена. Методом PCR усередині яєць непарного шовкопряда ДНК вірусу знаходили у 76 % випадків, а на поверхні - у 56 %.

6. Зовнішнє нанесення розчину двох коротких одноланцюгових фрагментів ДНК вірусу ядерного поліедрозу (фрагмент iap-3 гену-інгібітору апоптозу клітин хазяїна) викликає підвищення смертності гусениць непарного шовкопряда (P < 0,01).

7. Обробка личинок Drosophila melanogaster розчином двох коротких одноланцюгових фрагментів ДНК вірусу ядерного поліедрозу (фрагмент гену-інгібітору апоптозу клітин хазяїна, GENEID:1488470) також викликає підвищення смертності мушки (P < 0,05). Таким чином, ДНК-фрагменти вірусу призводять до загибелі клітини комахи, і певну роль у цьому відіграє апоптоз.

8. RAPD-PCR аналіз із праймером OPA-14 дозволив виявити генетичну відмінність особин непарного шовкопряда, повязану з інтенсивністю розвитку вірусної інфекції в організмі хазяїна. У особин із RAPD-фрагментами довжиною приблизно 150, 430, 850 і 1000 п.н. достовірно знижується відтворення і накопичення вірусу у тілі хазяїна, тобто вони визначають стійкість до вірусу (P < 0,05), а RAPD-фрагменти довжиною приблизно 330 і 560 п.н. - навпаки маркують чутливість комахи до вірусу (P < 0,05).

9. Використання RAPD-фрагментів (довжиною приблизно 150, 430, 850 і 1000 п.н.) та алелів естеразного локусу (F і S) непарного шовкопряда, асоційованих з чутливістю та стійкістю комахи до вірусного препарату „ВІРІН-НШ” та препарату на основі Bacillus thuringiensis дозволяє використовувати генетичний підхід у регуляції чисельності шкідливих комах. Він базується на визначенні генетичними методами біопрепарату, до якого більшість генотипів особин у популяції комахи найбільш чутливі.

1. Оберемок В. В. Методические рекомендации к применению ПЦР-метода / Оберемок В. В. - Симферополь: Таврический национальный университет шимени В. И. Вернадского, - 2008. - 35 с. - (Методичний посібник).

2. Оберемок В. В. Доказательство трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus (fam. Baculoviridae) методом RAPD-PCR / В. В. Оберемок // Журнал общей биологии. - 2008. - Т. 69, № 5. - С. 397 - 400.

3. Симчук А. П. Изоформы белков, эстераз и щелочной фосфатазы на личиночной стадии развития непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.) / А. П. Симчук, И. Г. Пелецкая, В. В. Оберемок // Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана: тематич. сб. науч. тр. - 2003. - Вып. 13. - С. 172-177. (автор брав участь у проведенні експерименту).

4. Оберемок В. В. Обнаружение методом RAPD-PCR ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда в гусеницах непарного шелкопряда I-го личиночного возраста / В. В. Оберемок // Ученые записки ТНУ. Сер. Биология, химия. - 2008. - Т. 21(60), № 2. - С. 97-101.

5. Сизых Л. М. К вопросу обнаружения трансовариальной передачи вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus) / Л. М. Сизых, В. В. Оберемок, С. И. Красильщикова // Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана: тематич. сб. науч. тр. - Симферополь, 2008. - Вып. 18. - С. 126-130. (автор брав участь в проведенні експерименту і написанні статті).

6. Оберемок В. В. Вплив одноланцюгових ДНК-фрагментів вірусу ядерного поліедрозу (Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus) на життєздатність гусениць його хазяїна непарного шовкопряда (Lymantria dispar) / В. В. Оберемок // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин. - Львів, 2009. - Вип. 10. - № 1-2. - С. 275-283.

7. Оберемок В. В. Використання генетичних маркерів у стратегії прийняття рішень з біологічного контролю чисельності непарного шовкопряда / В. В. Оберемок // Біологія тварин. - 2009. - Т. 11, № 1-2. - С. 71-82.

8. Пат. 35987 Україна, МПК (2006) А01М 1/20, Засіб діагностики ДНК-містячих вірусів, Оберемок В. В.; заявник та власник патенту Таврійський національний університет імені В. І. Вернадського. -№ u 2008 05942; заявл. 05.05.2008; опубл. 10.10.2008. Бюл. № 19.

9. Пат. 36445 Україна, МПК (2006) А01М 1/20, Засіб знищення листогризучих комах з ряду лускокрилих, Оберемок В. В.; заявник та власник патенту Таврійський національний університет імені В. І. Вернадського. - № u 2008 0674; заявл. 19.05.2008; опубл. 27.10.2008. Бюл. № 20.

10. Пат. 35990 Україна, МПК (2006) А01М 1/20, Засіб виявлення вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда, Вініченко О. В., Оберемок В. В.; заявник та власник патенту Таврійський національний університет імені В. І. Вернадського. - № u 2008 05945; заявл. 07.05.2008; опубл. 10.10.2008. Бюл. № 19 (автор брав участь в проведенні експерименту).

11. Пат. 50061 Україна, МПК (2009) А01М 1/20, Спосіб виявлення ДНК вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда, Оберемок В. В., Сімчук А. П., Разумейко В. Н., Івашов А. В; заявник та власник патенту Таврійський національний університет імені В. І. Вернадського. - № u 2009 11837; заявл. 19.11.2009; опубл. 25.05.2010. Бюл. № 19 (автор брав участь в проведенні експерименту).

12. RAPD-PCR fragments marking resistance and susceptibility of Lymantria dispar to nuclear polyhedrosis virus / A. V. Ivashov, A. P. Simchuk, V. V. Oberemok, V. V. Gouli // 38th Annual Meeting Society for Invertebrate Pathology, 7-11 August 2005: abstract book. - Anchorage (Alaska, USA). - P. 72. (автор брав участь в проведенні експерименту).

13. Оберемок В. В. Генетичні аспекти взаємодії непарного шовкопряда з вірусом ядерного поліедрозу та Bacillus thuringiensis / В. В. Оберемок, А. П. Симчук // Молодь та поступ біології: збірник тез II міжнар. конф. студентів і аспірантів, Львів, 21- 24 березня 2006. - Львів, 2006. - Т.1 - С. 149-150. (автор брав участь в проведенні експерименту і написанні тез).

14. Оберемок В. В. Перетворення рівняння Харді-Вайнберга у рівняння генетичного базису для опису динаміки частот алелів генів у системі взаємовідносин вірус-хазяїн / В. В. Оберемок // Молодь та поступ біології: збірник тез III міжнар. конф. студентів і аспірантів, Львів, 2007. - Львів, 23-27 квітня 2007. -Т.1-С.165-166.

15. Oberemok V. V. Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus: genetic markers of some processes / V. V. Oberemok // Conference for young scientists, PHD students and students on molecular biology and genetics, Kyiv, 20-22 September 2007: abstract book. - Kyiv, 2007 - P. 32.

16. Оберемок В.В. Деякі генетичні та фізичні характеристики вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда / В. В. Оберемок // Молодь та поступ біології: Збірник тез IV міжнар. конф. студентів і аспірантів, Львів, 7- 10 квітня 2008. - Львів, 2008. - Т.1 - С. 141-142.

17. Оберемок В. В. Разработка биопрепаратов на основе нуклеиновых кислот / В. В. Оберемок // Современное состояние и перспектив развития микробиологии и биотехнологии: материалы Междунар. науч. конф., Минск, 2 - 6 июня 2008. - Минск, 2008. - Т.2 - С. 374.

18. Oberemok V. V. Influence of a single chain DNA fragments of virus iap gene LDNVGP140 on viability of Lymantria dispar caterpillars / V. V. Oberemok // Укр. біохім. журн. - 2009. -Т. 8, № 4. (спеціальний випуск) - С. 171.