Исследование роли вазоактивных, ростовых и нейротрофических факторов в патогенезе диабетической периферической полинейропатии у детей и подростков. Разработка подходов к диагностике, оценке тяжести, прогнозированию течения и терапии данного осложнения.
Аннотация к работе
Одним из наиболее частых, но наименее изученных осложнений сахарного диабета в детском возрасте является диабетическая периферическая полинейропатия (ДПН) - дистальное симметричное поражение нервных волокон, преимущественно в нижних конечностях, характеризующееся развитием атрофии, дегенерации и демиелинизации аксонов. Вышеизложенное открывает перспективу для решения проблемы ранней диагностики, оценки тяжести, прогноза течения и оптимизации лечения этого грозного инвалидизирующего осложнения сахарного диабета 1 типа у детей и подростков. периферический полинейропатия диабетический дети подросток Цель работы: Изучить роль вазоактивных, ростовых и нейротрофических факторов в патогенезе диабетической периферической полинейропатии у детей и подростков и разработать новые подходы к ранней диагностике, оценке тяжести, прогнозированию течения и терапии данного осложнения сахарного диабета 1 типа, направленных на улучшение качества жизни пациентов. Изучить частоту, особенности клинического течения и факторы риска формирования диабетической периферической полинейропатии у детей и подростков, больных сахарным диабетом 1 типа, и выявить функциональное состояние периферической нервной системы с помощью инструментальных и электрофизиологических методов исследования у данного контингента больных. Определить уровень эндотелиальных факторов: вазоактивных (оксида азота, эндотелина-1) и ростовых (сосудистого эндотелиального фактора роста, основного фактора роста фибробластов) в сыворотке крови детей и подростков с сахарным диабетом 1 типа с учетом развития у них диабетической периферической полинейропатии.
Список литературы
По материалам диссертации опубликовано 33 научные работы, в том числе 14 статей в журналах Перечня ВАК МО и науки; получено 2 патента на изобретения «Способ прогнозирования диабетической периферической нейропатии у детей и подростков» № 2273028 от 27. 03.2006 г.; «Способ ранней диагностики диабетической периферической нейропатии у детей» № 2005104377/15 (005679) от 10.05.2006; получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Способ прогнозирования тяжелого течения диабетической периферической полинейропатии у детей и подростков» № 2007121432 от 7.06.2007 г.
Внедрение в практику здравоохранения
Материалы диссертации внедрены в работу отделения детской эндокринологии и поликлинического отделения ФГУ «Ростовского научно - исследовательского института акушерства и педиатрии Росмедтехнологий», кафедры эндокринологии с курсом детской эндокринологии ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет», ГУЗ «Детская краевая клиническая больница» ДЗ Краснодарского края, МЛПУЗ «Городской деткой поликлиники №45» г. Ростова - на - Дону, МУЗ «ЦГБ» г. Батайска Ростовской области, МУЗ «Детская городская больница» г.Волгодонска Ростовской области; используются при проведении семинаров с учебными ординаторами и в лекциях на тематических семинарах для врачей-педиатров и детских эндокринологов Южного Федерального Округа.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 261 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, приложения. Работа иллюстрирована 53 таблицами, 26 диаграммами и 4 схемами. Библиографический указатель содержит 237 источников, из них 80 отечественных и 157 - зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ
Общая характеристика материалов и методов исследования
Проведено проспективное, рандомизированное, открытое, сравнительное исследование 223 детей и подростков с СД 1, находившихся на лечении в детском эндокринологическом отделении ФГУ «РНИИАП Росмедтехнологий».
Исследование состояло из двух этапов. Задачами первого этапа были развернутое клинико-лабораторное обследование пациентов с целью верификации диабетической периферической полинейропатии; установление роли вазоактивных, ростовых и нейротрофических факторов в патогенезе данного осложнения; обоснование тактики терапевтических мероприятий.
В задачи второго этапа исследования входила оценка эффективности лечения диабетической полинейропатии у подростков препаратом альфа-липоевой кислоты «Тиоктацид БВ», обладающим антиоксидантным и умеренным гипогликемическим эффектом, и препаратом ипидакрина «Нейромидин», улучшающим нервно-мышечную проводимость.
На первом этапе исследования, в зависимости от наличия или отсутствия ДПН, согласно классификации P.Dyck и P.Thomas (1999), пациенты были разделены на 2 группы (рис.1):
Рисунок 1. Распределение детей и подростков с сахарным диабетом 1 типа с учетом наличия у них диабетической полинейропатии в I группу (ДПН «-») вошли 89 человек (39,9%) без клинических и функциональных признаков ДПН; во II группу (ДПН« ») - 134 пациента (60, 1%) с различной степенью выраженности ДПН. В группе (ДПН « ») были выделены две подгруппы: в первую подгруппу (ДПН «1 ») были включены 69 больных (31,0%) с субклинической стадией ДПН; во вторую подгруппу (ДПН«2 ») - 65 пациентов (29,1%) с клинической стадией ДПН. Контрольную группу составили 19 детей и подростков, не имевших неврологической патологии и нарушений со стороны эндокринной системы, в том числе углеводного обмена, на момент исследования.
Клинические исследования включали количественную оценку неврологических изменений по Общей шкале неврологических симптомов - Total Symptoms Score (TSS), по шкале Нейропатического Дисфункционального Счета (НДС), анализирующих нарушения болевой, тактильной, вибрационной чувствительности, изменения сухожильных рефлексов. Оценку выраженности вегетативных нарушений проводили с помощью посимптомного опросника (А.М. Вейн,1998). Для определения показателей качества жизни (КЖ) использовалась составленная авторами анкета самоконтроля диабета, с расчетом разработанного показателя самоконтроля диабета (ПСД).
Электромиографическое исследование нижних конечностей проводилось по методике изучения скорости распространения возбуждения по периферическим нервам на приборе «Нейромиан» (г.Таганрог).
Оценка степени компенсации углеводного обмена осуществлялась по уровню гликемического профиля и гликозилированного гемоглобина микроколоночным ионообменным методом («Human», Германия).
Определение активности альдозоредуктазы и сорбитолдегидрогеназы осуществлялось биохимическими методами.
Содержание в сыворотке крови метаболитов оксида азота определяли с использованием коммерческого реактива Грисса, эндотелина - 1 - наборами для иммуноферментного анализа фирмы R&D Systems (США), сосудистого эндотелиального фактора роста и основного фактора роста фибробластов - методом твердофазного иммуноферментного анализа наборами фирмы Cytimmune systems (США).
Уровень цилиарного нейротрофического фактора определяли диагностическими наборами фирмы R&D Systems (США), мозгового нейротрофического фактора - наборами фирмы DSL (США).
Статистическая обработка данных проводилась с использованием Excel-2003 и пакета прикладных программ Statistica-6 (О.Ю.Реброва, 2003). Анализ данных проводили с использованием описательной статистики (С.А.Айвазян и соавт., 1985; Г.Ф.Лакин, 1990). При этом оценивались значения медианы и интерквартильного размаха (25%,75%).Оценку наличия статистически значимых отличий между сравниваемыми группами проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни.В случае сравнения долевых признаков в двух независимых группах объектов исследования использовали точный критерий Фишера.Для оценки вероятности справедливости нулевой гипотезы использовали порог р?0,05. Для выявления взаимосвязи и взаимовлияния различных факторов был использован метод ранговой корреляции по Спирмену. Для формирования диагностического правила использовали метод ROC- кривых (Receiver-operating characteristic curve). С помощью разработанного макроса в среде Excel, использовался метод построения характеристической ROC- кривой, составлялись таблицы чувствительности и специфичности, анализ которых способствовал определению точки разделения (cutoff frequency) показателей. Для оценки точности, специфичности, чувствительности диагностического метода использовались возможности Excel-2003.
Результаты исследования и их обсуждение
Анализ причин, влияющих на формирование и тяжесть течения диабетической периферической полинейропатии у детей и подростков с СД 1, определил целый ряд факторов, способствующих развитию и прогрессированию ДПН. Так, в ходе исследования было установлено, что ДПН формировалась в основном в подростковом периоде: среди больных с субклинической стадией ДПН было зарегистрировано 47,8% пациентов пубертатного возраста от 10 до 15 лет и 34,8% подростков от 15 до 18 лет. Среди лиц с клинической стадией ДПН - 32,3% приходилось на пациентов пубертатного периода и 67,7% - на больных 15 - 18 лет.
Кроме того, среди обследованных отмечалось статистически значимое преобладание городских жителей (р =0,0001), что вероятно связано с урбанизацией, большей подверженностью стрессам, большей обращаемостью к врачам этой категории больных.
Отягощенная наследственность по сахарному диабету практически с одинаковой частотой была выявлена у пациентов ДПН «-» и ДПН« » групп, однако, отмечалась тенденция к преобладанию семейных случаев диабета у лиц с клинической стадией ДПН (52,3%), по сравнению с пациентами без ДПН - 41,6% (p=0,19).
Ведущими факторами, способствующими прогрессированию диабетической полинейропатии, являлись сроки манифестации СД 1 и длительность заболевания. В процессе исследования установлено, что у 29,1% пациентов группы ДПН « » пик начала заболевания СД 1 приходился на дошкольный возраст и у 31,3% - на пубертатный период, что позволило сделать заключение о том, что манифестация СД 1 у детей в возрасте до 7 лет и в пубертате являлась фактором риска формирования ДПН. Полученные данные можно объяснить тем, что и дошкольный возраст, и период полового развития - это «критические периоды» в онтогенезе человека, характеризующиеся гетерохронией - неравномерностью темпов развития различных органов и систем (Л.И.Левина,1999). Быстрый рост конечностей, мышц, сосудов, периферических нервов в этот период у детей и подростков, страдающих СД 1 и находящихся в стадии декомпенсации, может, по-видимому, служить неблагоприятным фоном раннего формирования диабетической полинейропатии. Прогрессирование ДПН отмечалось при длительном течении СД 1. Так, у 47,8% пациентов с ДПН « » длительность СД 1 составляла 5-10 лет и более; и это были преимущественно пациенты с клинической стадией ДПН «2 ».Связь тяжести ДПН со сроками манифестации и длительностью СД 1 подтверждалась результатами корреляционного статистического анализа, выявившего возрастание силы связи между возрастом манифестации и длительностью СД 1 по мере прогрессирования ДПН. У пациентов из группы ДПН «-» имела место умеренная отрицательная ( ранговый коэффициент корреляции по Spearman R= - 0,39) статистически значимая (уровень значимости p=0,0001) корреляционная связь, у пациентов же с клинической стадией ДПН сила связи увеличилась в 2 раза (R= - 0,78; p=0,0001 ). При длительном, декомпенсированном течении СД 1, характеризующемся лабильным течением, частыми гипогликемическими и кетоацидотическими состояниями, неудовлетворительным самоконтролем за состоянием углеводного обмена, отмечалось быстрое прогрессирование ДПН.
Обращало на себя внимание, что наряду с ДПН у обследованных пациентов из осложнений СД 1 наиболее часто встречались диабетическое поражение органов зрения (46,2%), сердца (25,6%), диабетический гепатоз (16,1%), нефропатия (13,5%). Причем по мере прогрессирования ДПН возрастало и количество имеющихся осложнений. Так, у 63% пациентов с клинической стадией ДПН имело место сочетание двух и более осложнений.
Полученные данные согласуются с исследованиями Г.И.Сивоус и соавт.(2002), Д.Е.Цымбал (2003), В.А.Петерковой и соавт. (2005), М.В.Комковой (2006), Н.В.Морозовой (2006), свидетельствующими о том, что прогрессирование ДПН обусловлено воздействием ряда взаимоотягощающих медико-социальных и биологических факторов, наиболее значимыми из которых являются сроки манифестации сахарного диабета, совпадающие с критическими периодами детства (дошкольным возрастом и периодом полового созревания), длительность и степень компенсации СД 1, возраст дебюта ДПН и наличие диабетических осложнений со стороны других органов и систем, состояние самоконтроля заболевания.
Без сомнения, механизмы формирования нейропатии нельзя рассматривать в отрыве от особенностей клинического течения заболевания. В процессе исследования было установлено, что у 65 детей и подростков с клинической стадией ДПН «2 » из субъективных ощущений преобладали жалобы на боли (81,5%) или парестезии (70,8%) в стопах, или голенях легкой или средней интенсивности, имевшие преимущественно эпизодический характер. Суммарная оценка интенсивности и частоты встречаемости основных симптомов у пациентов с клинической стадией ДПН по Общей шкале неврологических симптомов - Total Symptoms Score (TSS) составила 5,33 (3,66;7,33) балла. В то время как у 69 больных с субклинической стадией ДПН отмечалось асимптомное течение, субъективные признаки отсутствовали.
У 73,8% пациентов из ДПН «2 » подгруппы имело место снижение болевой, у 47,7% - снижение температурной чувствительности на нижних конечностях, что свидетельствовало о вовлечении в патологический процесс тонких волокон периферических нервов. Нарушения вибрационной чувствительности, являющиеся проявлением поражения толстых миелинизированных волокон периферических нервов, регистрировались преимущественно в дистальных отделах нижних конечностей у 43,1% пациентов с клинической стадией ДПН. Нарушения чувствительности сочетались с двигательными расстройствами в виде снижения ахилловых (83,1%) и коленных (56,9%) рефлексов. Следует отметить, что у пациентов с субклинической стадией ДПН нарушения чувствительности встречались реже и носили менее выраженный характер. Анализ тяжести и интенсивности сенсомоторных нарушений, оцененных по шкале Нейропатического Дисфункционального Счета (НДС), показал, что среди пациентов подгруппы ДПН «2 » выраженную ДПН (индекс по шкале НДС ?14 баллов) имели 15,4% больных, умеренную ДПН (индекс НДС - 5-13 баллов) - 76,9%, и соответствующий варианту нормы индекс по шкале НДС (0-4 балла) - 7,7% пациентов. В то же время, среди больных с субклинической стадией ДПН индекс по шкале НДС от 0 до 4 баллов регистрировался у 66,7% пациентов, и от 5 до 13 баллов (умеренно выраженная ДПН) - у 33,3%.
Сопоставление клинических данных с результатами диагностики поражения периферического нейро-моторного аппарата нижних конечностей, согласно электромиографической методике (ЭМГ) определения скорости распространения возбуждения (СРВ) по двигательным и чувствительным волокнам нервов нижних конечностей, также обнаружило более выраженные нарушения изучаемых параметров у пациентов с клинической стадией ДПН (рис.2).
Данные приведены в процентном отношении от нормы
Рисунок 2. Динамика электромиографических параметров у пациентов с различной стадией ДПН
Выявленные изменения у пациентов с клинической стадией ДПН характеризовались снижением амплитуды М-ответа и скорости распространения возбуждения (СРВ) двигательных нервов, а также нарастанием резидуальной латентности (РЛ) в дистальных отделах двигательных нервов.
Снижение амплитуды М-ответа могло свидетельствовать об уменьшении количества активированных двигательных единиц на дистальных отделах конечностей, с возможным вовлечением тонких волокон, что является характерным при нарушениях аксонального транспорта и свидетельствует, либо о функциональной несостоятельности аксонов, либо о частичной гибели аксонов или мышечных волокон (Б.М. Гехт и др., 1997). Эти проявления аксонопатии, нарушения надежности нервно-мышечной передачи и нарастающей дегенерации нервных волокон, свидетельствовали о прогрессировании ДПН.
По мере прогрессирования ДПН отмечалось статистически значимое снижение СРВ по двигательному малоберцовому нерву, являющейся ценным показателем функции периферического аксона и характеризующего состояние толстых быстропроводящих миелинизированных волокон. Так медиана СРВ по n. peroneus dextra в группе ДПН«-» была 53,9(51,9;58,1) м/с, в подгруппе ДПН«1 »-53,3(50,0;57,2) м/с (РДПН«-»/ДПН«1 »=0,13) и в подгруппе ДПН «2 » - 45,5 (43,7; 47,2) м/с (РДПН«-»/ДПН«2 »=0,0001, РДПН«1 »/ДПН«2 »= 0,0001).
Определение СРВ по наиболее дистальным немиелинизированным участкам аксонов, оценивавшейся по величине резидуальной латентности (РЛ), выявило увеличение показателей РЛ по мере прогрессирования ДПН. Так, медиана РЛ в группе ДПН«-» составила 2,7 (2,3;3,0) м/с, в подгруппе ДПН«1 »-4,9 (4,6;7,6) м/с (p ДПН«-»/ДПН«1 »= 0,0001) и в подгруппе ДПН«2 » - 8,6 (7,9;10,0) м/с (РДПН«-»/ДПН«2 »= 0,0001; РДПН «1 »/ДПН«2 »= 0,0001). Нарушение процессов проведения по нервному волокну могло быть следствием прогрессирующей потери миелинизированных волокон - сегментарной демиелинизации и аксональной дегенерации, лежащих в основе формирования ДПН (С.В. Котов, И.Г. Рудакова, 2000, Г.И.Сивоус и соавт.,2003). Вероятно существенные изменения аксональных цилиндров, возможно частичная гибель аксонов, привели к вторичному демиелинизирующему процессу у обследованных пациентов, характеризующемуся снижением СРВ и нарастанием РЛ.
Полученные ЭМГ-данные позволили сделать вывод, что при длительном декомпенсированном течении диабета уже в детском возрасте отмечается аксонопатия, нарастающая потеря миелиновых волокон; вследствие чего нарушаются процессы проведения импульсов по нервному волокну, приводящие к прогрессированию ДПН.
Обнаруженные в процессе корреляционного анализа сильные и умеренные статистически обоснованные отрицательные связи между основными параметрами ЭМГ и суммарной оценкой по шкалам TSS и НДС [Амплитуда М-ответа и TSS - R= (- 0,95), p =0,001; СРВ и НДС - R= (- 0,48), p =0,0001], а также умеренные положительные корреляции между оценочными шкалами, длительностью ДПН и степенью компенсации СД 1 [длительность ДПН и НДС - R= 0,42, p =0,001; HBA1c и TSS - R=0,41, p = 0,02], также подтверждали наличие причинно-следственных связей между изучаемыми параметрами.
Таким образом, анализ причин формирования и клинико-функциональных особенностей течения ДПН в детском возрасте, позволил выявить определенные медико-биологические закономерности течения ДПН у детей и подростков. Это явилось обоснованием к разработке новых прогностических критериев диагностики ДПН у детей и подростков на основании изучения патогенетических механизмов поражения периферической нервной системы у больных с сахарным диабетом 1 типа.
Для изучения патогенетических аспектов формирования ДПН в детском возрасте, нами был проведен комплексный анализ влияния степени компенсации углеводного обмена, содержания нейротрофических и эндотелиальных факторов, лежащих в основе метаболической и сосудистой теории патогенеза нейропатии, на прогрессирование ДПН у детей.
Было отмечено, что ДПН быстрее прогрессировала у пациентов с длительной декомпенсацией сахарного диабета и неудовлетворительным самоконтролем за состоянием углеводного обмена. Так, у больных без ДПН медиана HBA1c составляла 7,5 (6,4; 8,4)% и имела статистически значимые отличия от показателей больных с субклинической стадией ДПН - 8,0 (7,2;9,3)% (р=0,01), и с клинической стадией ДПН - 9,0 (7,9:11,5)% (р=0,0001). Кроме того, для пациентов с клинической стадией ДПН, в отличие от больных без ДПН, были характерны склонность к частым гипогликемическим состояниям (38,5% и 12,4%, соответственно, р=0,0002), легкость развития кетоза (41,5% и 27%, соответственно, р=0,04), лабильность течения сахарного диабета.
Поскольку в основе метаболической теории развития диабетической полинейропатии у взрослых с сахарным диабетом 2 типа лежит избыточное накопление сорбитола в результате активации полиолового пути метаболизма глюкозы, одной из задач настоящего исследования явилось изучение активности ферментов полиолового пути (альдозоредуктазы и сорбитолдегидрогеназы) при сахарном диабете 1 типа у детей и подростков, оценка их роли в формировании ДПН в детском возрасте.
Проведенные исследования не выявили статистически значимых различий между показателями альдозоредуктазы у больных с СД 1 [0,2 (0,1; 0,5) МЕ] и пациентов группы контроля [0,2(0,2;0,3)МЕ, p>0,05]. Не отмечено различий в концентрации альдозоредуктазы в сыворотке крови пациентов в зависимости от длительности, степени компенсации СД 1, стадии ДПН.
В то же время активность сорбитолдегидрогеназы у детей с СД 1 [34,8(12,2;77,4) нмоль/с•л] значительно превышала показатели СДГ у пациентов контрольной группы [7,0(0,1;10,6) нмоль/с•л, p=0,005]. Статистически значимо концентрация СДГ повышалась у пациентов с высоким риском декомпенсации СД 1 [55,7(37,4;96,3) нмоль/с•л], по сравнению с пациентами с оптимальной компенсацией заболевания [20,8(12,1;61,8) нмоль/с•л, p=0,02]. Также гиперпродукция СДГ была зарегистрирована (рис.3) у пациентов с клинической стадией ДПН [50,1(20,0;85,0) нмоль/с•л] по сравнению с больными без ДПН [23,3(8,0;65,3) нмоль/с•л, p=0,03].
Таким образом, нарастающая по мере прогрессирования ДПН и декомпенсации сахарного диабета 1 типа СДГ-гиперферментемия может свидетельствовать об активации сорбитолового пути утилизации глюкозы у детей с диабетической полинейропатией. Активация мощного энергозатратного пути утилизации глюкозы у детей и подростков с СД 1, в основе которого лежит абсолютный дефицит инсулина, усугубляет имеющийся энергодефицит и способствует быстрому прогрессированию метаболических нарушений.
Рисунок 3. Содержание сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови детей и подростков с различной стадией диабетической периферической полинейропатии
С целью выявления роли нейротрофических факторов в формировании ДПН у детей и подростков с СД 1 и разработки новых информативных критериев прогнозирования течения ДПН в детском возрасте у 176 обследованных больных с СД 1 (79% из 223) было оценено содержание в сыворотке крови цилиарного (ciliary neurotrophic factor, CNTF) и у 130 (58,3% из 223) - мозгового (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) нейротрофических факторов. Анализ полученных результатов выявил статистически значимое повышение уровня CNTF [20,4 (10,8; 43,1) пкг/мл] и BDNF [9283 (8417;9985) пкг/мл] в сыворотке крови больных с СД 1, в сравнении с группой контроля [12,2 (10,3;18,3) пкг/мл, p=0,001 и 7185 (6100;7996) пкг/мл, p=0,0001, соответственно]. Для изучения возможных взаимосвязей нейротрофических факторов с клинико-лабораторными и электрофизиологическими параметрами был проведен корреляционный анализ, в результате которого была установлена прямая тесная взаимосвязь между изучаемыми концентрациями CNTF и BDNF (R= 0,76 при p=0,0023). Это свидетельствует об однонаправленности предполагаемых изменений, что было подтверждено полученными результатами.
Возможная взаимосвязь между обменными нарушениями при сахарном диабете и экспрессией BDNF и CNTF, на наш взгляд обусловлена тем, что рецепторы инсулина, также как часть рецепторного аппарата нейротрофинов, известны как рецепторные тирозинкиназы, то есть их внутриклеточные домены - тирозинкиназы, фосфолирирующие белки Ras-каскада (Э.Г. Улумбеков, Ю.А.Челышев,1997), что, возможно, и является объединяющим фактором патогенетических нарушений. Эта мысль нашла подтверждение в экспериментальных работах A.Tsuchida et al. (2001), оценивавших эффекты BDNF на активность инсулина в периферических нервных волокнах мышей с диабетом. Авторы установили, что одноразовое подкожное или внутрижелудочковое введение мозгового нейротрофического фактора быстро увеличивает стимулированное инсулином фосфорилирование тирозина инсулиновых рецепторов и активность фосфатидилинозитол-3- киназы в печени и периферических волокнах скелетных мышц у мышей с стрептозотоцининдуцированным сахарным диабетом.
Принимая во внимание исследования T. Nakagawa et al. (2002), установивших, что BDNF усиливал гипогликемический эффект инсулина у мышей со стрептозотоцининдуцированным сахарным диабетом (то есть обладал гипогликемической активностью), мы проанализировали содержание нейротрофических факторов в сыворотке крови детей и подростков с различной длительностью и степенью компенсации СД 1.
Установлено, что уровень BDNF у лиц (n=37) с субоптимальным (HBA1c - 7,6 - 9,0%) контролем [9407 (8923; 12880) пкг/мл], и высоким (HBA1c >9,0%) риском (n=51) декомпенсации СД 1 [9703 (8916;13395) пкг/мл], был достоверно выше, чем у больных (n=42) с оптимальным (HBA1c <7,6%) контролем [8798 (8077;9260) пкг/мл] диабета (p=0,0005; p=0,0002; соответственно). В то же время, нарастание клинико - метаболической декомпенсации СД 1 у обследованных пациентов не сопровождалось существенными отличиями концентрации сывороточного уровня CNTF: у пациентов (n=68) с оптимальным контролем- 20,9(11,2;40,0) пкг/мл, у пациентов (n=57) с высоким риском декомпенсации СД 1- 20,4(10,3;50,8) пкг/мл. Полученные в процессе исследования статистически значимые обратные умеренные корреляционные связи между уровнями CNTF и HBA1c (R= - 0,2523, при p=0,04), BDNF и HBA1c (R= - 0,3729, при p=0,02), подтвердили наличие взаимосвязи между уровнями нейротрофинов и показателями углеводного обмена у детей и подростков с СД 1.
Что касается характера изменений нейротрофических факторов в зависимости от длительности СД 1, было установлено, что у пациентов с длительным течением СД 1 имела место четкая тенденция к нарастанию уровня BDNF в сыворотке крови. Так, в течение первых 10 лет заболевания был очевиден статистически значимый рост уровня BDNF [9570(8887; 10000) пкг/мл] в сыворотке крови больных, относительно его содержания в контрольной группе [7185(6100; 7996) пкг/мл, p =0,0001] и у пациентов с длительностью заболевания до 1 года [8660 (8101; 8940) пкг/мл, p =0,01]. Спустя 10 лет заболевания отмечалась тенденция к снижению уровня BDNF [9340(4227;10701) пкг/мл].
Концентрация же цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) статистически значимо (p=0,008) превышала контрольные значения [12,2 (10,3;18,3) пкг/мл] лишь у пациентов с длительностью заболевания 5-10 лет [23,9 (11,6;57,5) пкг/мл].
Представляют интерес данные, полученные при анализе содержания нейротрофических факторов у пациентов с различной стадией диабетической полинейропатии (рис.4,5). Проведенное исследование выявило у пациентов с субклинической стадией ДПН статистически значимое повышение концентрации мозгового [9560 (9228;9895) пкг/мл, n=46] и цилиарного нейротрофического факторов [24,7(14,4;51,2) пкг/мл, n=68], по сравнению с контрольной группой [(7185 (6100;7996) пкг/мл, p =0,0001)] и [12,2 (10,3;18,3) пкг/мл, p=0,001, соответственно] и группой пациентов без ДПН [8464 (7932; 8956) пкг/мл, n=46, p=0,0001)] и [18,5 (10,7; 26,8) пкг/мл, n=47, p=0,01, соответственно]. Повышение концентрации нейротрофических факторов в начальный период ДПН, вероятно, обусловлено рефлекторной экспрессией BDNF и CNTF шванновскими клетками в ответ на начинающиеся дегенеративные изменения аксонального аппарата с целью улучшения нейротрофики.
Сравнительный анализ клинических, лабораторных и электрофизиологических параметров выявил, что при повышении уровня BDNF выше 9000 пкг/мл у детей и подростков с сахарным диабетом 1 типа, без клинических признаков диабетической полинейропатии, регистрировались начальные патологические изменения на электромиограммах (незначительное снижение амплитуды М-ответа, увеличение резидуальной латентности двигательных и чувствительных нейронов наиболее дистальных из обследуемых мышц). Эти изменения соответствовали субклинической стадии ДПН.
Анализ полученных результатов позволил установить, что повышение уровня BDNF выше 9000 пкг/мл у детей и подростков с СД 1 может являться ранним прогностическим признаком формирования субклинической стадии ДПН, предшествующим электрофизиологическим изменениям («Способ прогнозирования диабетической периферической нейропатии у детей и подростков», патент на изобретение № 2273028 от 27.03.2006 г.). Точность данного метода составила 85,28%, чувствительность -89,47%; специфичность -78,26%.
Изучение динамики изменения цилиарного нейротрофического фактора у 46 пациентов с субклинической стадией ДПН, с уровнем BDNF, превышающим 9000 пкг/мл, выявил у них аналогичное повышение концентрации CNTF выше 30 пкг/мл. Приведенные данные позволили предложить новый тест прогнозирования субклинической стадии ДПН, основанный на оценке поражения периферических нервно-мышечных волокон по уровню цилиарного нейротрофического фактора в сыворотке крови пациентов с сахарным диабетом 1 типа. Предлагаемый новый тест позволяет прогнозировать субклиническую стадию ДПН при уровне CNTF в сыворотке крови более 30 пкг/мл.
Рисунок 4. Динамика уровня мозгового нейротрофического фактора у детей и подростков в зависимости от стадии диабетической периферической полинейропатии
Рисунок 5. Изменение уровня цилиарного нейротрофического фактора у пациентов в зависимости от стадии диабетической полинейропатии
В последующем, по мере прогрессирования ДПН, у пациентов с клинической стадией ДПН показатели BDNF 10000 (9123,8; 13480) пкг/мл и CNTF 20,2(5,2;51,2) в сыворотке крови статистически значимо не отличались от уровней нейротрофинов у больных с субклинической стадией (p=0,32 и p=0,08, соответственно), однако отмечалось появление нейропатических жалоб и достоверное ухудшение ЭМГ показателей.
Индивидуальный анализ клинических, функциональных и лабораторных параметров внутри группы ДПН»2 » выявил снижение экспрессии CNTF у 16 пациентов (26,2% из 61) с клинической стадией ДПН [(0,2- 5,8) пкг/мл]. Следует отметить, что анализируемые низкие показатели CNTF были достоверно ниже не только относительно значений CNTF у всех больных СД 1, но и в 2 раза ниже показателей контрольной группы. Все пациенты со сниженной экспрессией CNTF были старше 15 лет, с длительностью СД 1 более 10 лет, с неудовлетворительным контролем, лабильным течением, наличием в анамнезе гипо- и/или гипергликемических коматозных состояний, выраженной дислипемидемией, высокой суточной потребностью в инсулине (выше 1,5 единицы/кг), с сопутствующими диабетическими осложнениями (ангиопатией, кардиопатией, нефропатией, гепатозом, липодистрофиями, некробиозом, хайропатией).
У данной группы больных выявлены также наиболее выраженные патологические ЭМГ параметры. Так, при проведении электромиографической методики определения скорости распространения возбуждения (СРВ) выявлено резкое снижение амплитуды М-ответа (<0,58 мв), СРВ по двигательному и сенсорному нервам (< 40 м/с). Показатель резидуальной латентности, свидетельствующий о проведении возбуждении по наиболее дистальным отделам, превышал более чем в 2 раза нормативные параметры - 6,78 (5,47; 7,66) м/с. Все указанные патологические характеристики могли свидетельствовать не только о вовлечении в патологический процесс аксонального аппарата, но и о происходящей демиелинизации.
Учитывая, что основным предполагаемым местом экспрессии CNTF в периферической нервной системе являются шванновские клетки, снижение концентрации нейротрофина, вероятно, обусловлено истончением миелиновой оболочки и истощением, соответственно, резервных возможностей экспрессии (M. Prugining-Bluger et al.,1997; K. Obata et al.,2004), чем можно объяснить ухудшение клинических и электрофизиологических параметров у пациентов с клинической стадией ДПН, длительно болеющих СД 1.
Исходя из этого, для подтверждения роли цилиарного нейротрофического фактора в формировании тяжелого течения ДПН у детей и подростков, страдающих СД 1, был проведен статистический анализ полученных данных. С помощью разработанного макроса в среде Excel, используя метод построения характеристической ROC (Receiver-operating characteristic curve) - кривой, нами была получена таблица чувствительности и специфичности, анализ которой позволил найти точку разделения (cutoff frequency) концентраций CNTF - 5,8 пкг/мл. Полученные данные позволили установить, что при значениях CNTF 5,8 пкг/мл и ниже у 16 детей и подростков развивалось тяжелое течение ДПН, характеризующееся комплексом клинических симптомов и электромиографических параметров.
В результате исследования впервые было доказано, что снижение уровня цилиарного нейротрофического фактора в сыворотке крови у детей и подростков с СД 1 до 5,8 пкг/мл и ниже является ранним прогностическим признаком тяжелой стадии ДПН (Решение о выдаче патента на изобретение «Способ прогнозирования тяжелого течения диабетической периферической полинейропатии у детей и подростков» №2007121432/15 (023329) от 28.03.2008). Точность данного метода составила 93% , чувствительность - 76%; специфичность - 95,5%.
Таким образом, можно сделать заключение о том, что в основе тяжелых клинических проявлений ДПН у детей и подростков лежит нарастающее на фоне декомпенсации СД 1 истощение синтеза нейротрофических факторов, преимущественно CNTF, приводящее к дегенерации нейронов. Имеющиеся экспериментальные данные (A.P.Mizisin, 2004) свидетельствующие о том, дефицит CNTF в результате активации полиолового пути в шванновских клетках усугубляет нарушения в периферических нервах при экспериментальном диабете, подтверждают полученные нами данные.
Анализ соответствия нового теста эталонному «золотому стандарту» - электромиографии, показал, что чувствительность теста по сывороточному уровню CNTF (68,9%) в 2 раза выше чувствительности ЭМГ-теста (31,1%), при практически одинаковой высокой специфичности обоих методов (89,5% и 94,7%, соответственно). Более высокая чувствительность предлагаемого способа прогнозирования тяжелого течения диабетической периферической полинейропатии у детей и подростков позволяет по отрицательному результату с большей вероятностью исключить наличие ДПН или ее легкое течение. Это подтверждается и более высокими показателями прогностичности отрицательного результата (32,1% и 21,2%, соответственно) и отношения правдоподобия для отрицательного результата - (3 и 1,6, соответственно).
Принимая во внимание данные о том, что патогенез диабетической полинейропатии в первую очередь связан с повреждающим действием гипергликемии на эндотелий сосудов, мы изучили содержание в сыворотке крови детей и подростков с сахарным диабетом 1типа вазоактивных эндотелиальных факторов (метаболитов оксида азота и эндотелина - 1) и ростовых факторов, влияющих на регенераторные процессы в эндотелии (сосудистого эндотелиального фактора роста и основного фактора роста фибробластов).
Научный интерес проведения данного исследования обусловлен тем, что сведения о характере изменений вышеуказанных вазоактивных и ростовых эндотелиальных факторов у детей и подростков, больных сахарным диабетом 1 типа, немногочисленны и разноречивы.
При проведении настоящего исследования установлено значительное снижение уровня метаболитов оксида азота - NOX [21,5 (13,0;29,0) мкмоль/л] и основного фактора роста фибробластов - BFGF [1,2 (0,8;4,0) нг/мл] у больных сахарным диабетом 1 типа, относительно контрольных данных [NOX - 33,7 (24,0;39,8) мкмоль/л, р=0,0001; BFGF - 4,3 (3,1;5,8) нг/мл, р=0,01]. Вместе с тем, содержание эндотелина-1 - ET-1 [35,5 (20,0;74,6) пкг/мл] у наблюдаемого контингента больных было повышено по сравнению с контролем [12,4 (7,2;15,6) пкг/мл, р=0,0001] практически в 3 раза, а уровень сосудистого эндотелиального фактора роста - VEGF [17,2 (7,5;56,3) пкг/мл] был в 3,5 раза выше, чем у пациентов контрольной группы [4,6 (2,6; 7,8) пкг/мл, р=0,04].
Представленные данные свидетельствуют о том, что значительные изменения уровня изучаемых эндотелиальных факторов у детей и подростков, страдающих СД 1, являются проявлением имеюшейся у них выраженной эндотелиальной дисфункции. Наличие дисбаланса эндотелиальных факторов у детей и подростков с СД 1 поставило вопрос: влияет ли формирование ДПН, длительность и степень компенсации СД 1 на характер выявленных нарушений?
Анализ содержания эндотелиальных факторов в сыворотке крови детей и подростков с СД 1, с учетом развития у них диабетической полинейропатии, выявил преобладание процессов вазоконстрикции уже на субклинической стадии ДПН (рис.6).
Рисунок 6. Динамика эндотелиальных факторов сыворотки крови у пациентов в зависимости от стадии диабетической полинейропатии
Это выражалось снижением генерации оксида азота [18,5 (10,5;23,5)мкмоль/л] и повышением содержания эндотелина-1 [53,5(39,4; 119,1) пкг/мл], по сравнению с показателями пациентов, не имевших ДПН [NOX - 21,5 (16,0;28,5) мкмоль/л, р = 0,02; ET-1 - 28,4 (20,5; 35,1) пкг/мл, р = 0,0001].
Известно, что высокие концентрации эндотелина активируют рецепторы на гладкомышечных клетках, стимулируя стойкую вазоконстрикцию, против которой направлено вазодилатирующее действие оксида азота (И.И.Александрова и соавт.,2004; Wilkinson et al.,2004). Полученные результаты свидетельствуют о том, что у детей и подростков с СД 1 истощение запасов вазодилататора NOX происходит уже на начальных этапах формирования ДПН, что сопровождается преобладанием процессов вазоконстрикции, приводящей к снижению эндоневрального кровотока, ишемии периферических нервов. По мере прогрессирования ДПН у пациентов с клинической стадией указанные изменения имели прежние тенденции [NOX - 20,0 (9,3;31,8) мкмоль/л, РДПН«-»/ДПН«2 » = 0,05; ET-1 - 40,0 (25,9; 104,3) пкг/мл, РДПН«-»/ДПН«2 » = 0,0002], что свидетельствует о сохранении дисбаланса между вазоконстрикцией и вазодилатацией.
Полученные данные соответствуют результатам экспериментальных исследований K.Almhanna et al. (2002), изучавших на моделях диабетических животных влияние гипергликемии на экспрессию эндотелина-1. Авторами было установлено, что под влиянием гипергликемии регистрируется сверхэкспрессия ET-1 в нервах и культуре шванновских клеток, что приводит к нарушению пролиферации и/или дифференцировки шванновских клеток, способствующих формированию диабетической нейропатии. Патогенетическая роль эндотелина -1 в развитии выраженной эндоневральной гипоксии уже на ранних этапах формирования ДПН была доказана и в исследованиях R.A.Malik et al. (2005). Кроме того, в экспериментальных исследованиях A.A.Sima (2003) было установлено, что эндогенный NO вырабатывается не только в пре- и постсинаптической области нервно-мышечного синапса, но и в шванновских клетках при денервации, что позволило автору предположить, что NO играет одну из первостепенных ролей в патогенезе ДПН. Снижение продукции NO в седалищном нерве стрептозотоцининдуцированных крыс, в том числе в поврежденных шванновских клетках, нашло подтверждение и в исследованиях M.Ii et al. (2005).
Что касается динамики ростовых эндотелиальных факторов, то у детей и подростков без ДПН уровень VEGF [8,5 (5,6;20,4) пкг/мл] статист