Ідентифікація нових генів (hUNC93, кінази MLK4, калієвого каналу Kv1.7) людини з використанням нуклеотидної послідовності NotI-"зв’язувальних" клонів. Визначення рівня експресії в різних тканинах, геномної структури та хромосомної локалізації генів.
Аннотация к работе
Незважаючи на визначення майже повної нуклеотидної послідовності геному людини, на сьогодні ідентифіковано лише 10,3 тисяч генів людини із 30-40 тисяч генів, які було вираховано, використовуючи інформацію із секвенування геному людини (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001; Venter et al., 2001). Існує декілька методів ідентифікації генів у геномній ДНК людини: 1) використання нуклеотидної послідовності відомих МРНК та EST (expressed sequence tag) із баз даних EMBL, GENBANK і DDBJ; 2) застосування амінокислотної послідовності відомих білків із баз даних SWISSPROT та TREMBL; 3) використання таких компютерних програм, як Genscan, FGENES, Genie та Grail. Перевагою використання аналізу нуклеотидної послідовності геномної ДНК для ідентифікації нових генів є те, що у геномній ДНК, на відміну від різної представленості транскриптів в РНКОВІЙ популяції, кожен ген представлений в еквімолярній кількості, що дозволяє ідентифікувати гени незалежно від рівня та місця їх експресії. Недоліком застосування нуклеотидної послідовності відомих МРНК та EST із баз даних EMBL, GENBANK і DDBJ є те, що КДНК більшості генів-гомологів та генів-ортологів не мають значної гомології на 3’-нетрансльованих ділянках, в той час, як значна частина КДНКОВИХ бібліотек була створена з використанням праймера oligo DT, призводячи до надмірної представленості 3’-нетрансльованих ділянок КДНК генів у базах даних EMBL, GENBANK та DDBJ. 2) визначити NOTI-”звязувальні” клони, що виявляють гомології, які характерні для генів - гомологів та для генів - ортологів (у тому випадку, коли відповідний ген людини невідомий), відібрати для ідентифікації та ідентифікувати декілька генів із потенційно важливими функціями;Секвенування NOTI-“звязувальних” клонів та КДНК ідентифікованих генів виконували за допомогою набору реактивів “ABI Prism BIGDYE terminator cycle sequencing ready reaction kit” (Perkin Elmer, США) відповідно до стандартного протоколу. Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) виконували в 50 мкл розчину, який містив 10 нг КДНК з набору реактивів “Marathon ready CDNA” (Clontech, США) або 50 нг лейкоцитарної геномної ДНК, 5 мкл буфера 3 із набору реактивів “Expand long template PCR system” (Boehringer, Німеччина), 3 мкл 2MM DNTP, 1 мкл кожного з 10 МКМ праймерів та 0,5 мкл суміші Taq ДНК - полімерази і Pwo ДНК-полімерази з набору реактивів “Expand long template PCR system” (Boehringer, Німеччина). 5’-та 3’-RACE виконували за допомогою набору реактивів “Marathon ready CDNA” (Clontech, США) згідно з протоколом виробника, використовуючи специфічний для певного гена праймер та універсальний праймер АР1. Для проведення зворотно транскрипційної полімеразної ланцюгової реакції використовували набір реактивів “SUPERSCRIPT one-step RT-PCR system” (Life Technologies, США) згідно з протоколом виробника. Фільтр було гібридизовано протягом 14-16 годин при температурі 42ОС у розчині, який містив 50% формаміду, 5? розчин Денхардта, 5? SSC, 0,5% SDS, 100 мкг денатурованої ДНК сперми лосося на 1 мл розчину.Для виведеної амінокислотної послідовності білка Kv1.7 людини виявлено 90% ідентичності до білка Kv1.7 миші та значно менший рівень ідентичності до інших білків калієвих каналів людини (70% до Kv1.4 людини). Kalman та співробітниками було показано, що відкрита рамка зчитування гена Kv1.7 миші кодує 532 амінокислоти (Kalman et al., 1998), що на 76 амінокислот більше, ніж виведена амінокислотна послідовність білка Kv1.7 людини. Враховуючи високу амінокислотну подібність білків Kv1.7 людини та миші, було запропоновано гіпотезу про те, що невірна нуклеотидна послідовність на 5’-кінці гена Kv1.7 миші зумовлює зсув рамки зчитування на 5’-кінці цього гена. Аналіз інформації із секвенування геному людини, яка депонована в базах даних EMBL, GENBANK та DDBJ, показав, що ген Kv1.7 людини знаходиться на ВАС клоні СТВ-60В18 поряд із генами CGB, SNRP70 та NTF5. За допомогою програми BLASTX показано, що виведена амінокислотна послідовність, яка кодується геном HUNC93 людини, виявляє 21% ідентичності впродовж 487 амінокислот до білка UNC93 Caenorhabditis elegans (Реєстраційний номер у GENBANK Z81449), 86% ідентичності впродовж 118 амінокислот до білка UNC93 миші (Реєстраційний номер у GENBANK U89424), 62% ідентичності впродовж 275 амінокислот до білка UNC93 курчати (Реєстраційний номер у GENBANK AJ271977), 22% ідентичності впродовж 478 амінокислот до білка UNC93 дрозофіли (Реєстраційний номер у GENBANK AF145657) та 31% ідентичності впродовж 63 амінокислот до гіпотетичного білка Arabidopsis thaliana (Реєстраційний номер у GENBANK AC016661).На основі отриманих гомологій відібрано, ідентифіковано та охарактеризовано три нових гени людини: ген калієвого каналу Kv1.7, ген HUNC93 та ген кінази MLK4. Вивчено експресію ідентифікованих генів людини та встановлено її тканиноспецифічний характер: найвищий рівень експресії гена калієвого каналу Kv1.7 виявлено у скелетних мязах, серці, печінці та нирках, гена HUNC93 - у серці та мозку, гена кінази MLK4 - у підшлунковій залозі, нирк