Вивчення ідентифікації структурних та регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну у флавіногенних дріжджів Candida famata. Біохімічна характеристика реципієнтних штам для клонування структурних генів, задіяних у біосинтезі. Метод інсерційного мутагенезу.
Аннотация к работе
На сьогоднішній день досягнуто значних успіхів у вивченні шляху біосинтезу рибофлавіну (РФ) та його регуляції у флавіногенних дріжджів. Для вивчення молекулярних механізмів регуляції флавіногенезу у дріжджів C. famata і конструювання надпродуцентів РФ важливе значення має ідентифікація структурних і регуляторних генів даного процесу та їх дослідження. До початку даної експериментальної роботи не було ідентифіковано жодного гену, що бере участь в біосинтезі РФ та регуляції цього процесу у флавіногенних дріжджів C. famata. Ідентифікувати регуляторні гени позитивного типу дії, що контролюють біосинтез РФ у C. famata методом функціональної гомологічної комплементації. ген біосинтез рибофлавін У роботі вперше отримано та охарактеризовано колекцію мутантів C. famata ауксотрофних за РФ; ідентифіковано структурні гени біосинтезу РФ RIB1, RIB2, RIB5, RIB6 та RIB7 з банку генів C. famata методом функціональної гомологічної/гетерологічної комплементації; за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) ізольовано та ідентифіковано ген RIB3 Debaryomyces hansenii (спорогенна форма C. famata); оптимізовано систему інсерційного мутагенезу для C. famata; розроблено систему селекції для ідентифікації регуляторних генів позитивного типу дії, що контролюють флавіногенез у дріжджів C. famata; ідентифіковано та клоновано три гени СКА 2, MET2, SEF1, залучені у регуляцію позитивного типу дії біосинтезу РФ у C. famata.1979); штами дикого типу Debaryomyces hansenii CBS 767 та Candida famata VKM Y-9; РФ-залежні штами C. famata (leu2 rib1, leu2 rib2, leu2 rib3, leu2 rib5, leu2 rib6, leu2 rib7), штам leu2 rf(-Fe), що втратив здатність до надсинтезу РФ за умов дефіциту іонів заліза в середовищі, отримані шляхом ультрафіолетового-мутагенезу (УФ-мутагенезу) та штами rib1::LEU2, met2::LEU2, sef1::LEU2, отримані за допомогою інсерційного мутагенезу. Фрагмент, що містить ген RIB3 було ізольовано за допомогою ПЛР з використанням специфічних праймерів до 5’ (5’-AAA CTG CAG TCT ACT TCT GGC GGC GAA TC-3’) і 3’ (5’-AAA CTG CAG AGG AGG ACC ATA GAA ATA C-3’) фланкуючих ділянок локалізованої відкритої рамки трансляції (ВРТ) та хромосомної ДНК D. hansenii CBS 767 як матриці та клоновано у складі реплікативної для P. guilliermondii плазміди. Фрагмент ДНК S. cerevisiae, що несе ген LEU2, позначено товстою сірою лінією; CFARS-послідовність позначено товстим чорним відрізком; фрагменти ДНК C. famata, що несуть гени RIB1, RIB2, RIB6, RIB7, RIB5 позначено незабарвленими відрізками; PGARS - товстою посмугованою лінією; послідовність PUC19 - тонкою лінією. Такі мутанти є ауксотрофами за РФ на середовищі з оптимальним для росту вмістом іонів заліза, та проявляють прототрофність на середовищі з дефіцитом іонів заліза. Було відібрано низку мутантів, що були ауксотрофами за РФ на середовищі з оптимальним для росту вмістом іонів заліза, та прототрофами за РФ на середовищі з дефіцитом іонів заліза або при додаванні іонів кобальту.Клоновано гени RIB1, RIB2, RIB5, RIB6 та RIB7 з банку генів C. famata методом функціональної гомологічної/гетерологічної комплементації, що кодують ГТФ-циклогідролазу ІІ, 2,5-диаміно-4-окси-6-рибозиламінопіримідин-5’-фосфатредуктазу, 6,7-диметил-8-рибітиллюмазинсинтазу, 3,4-дигідрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтазу та рибофлавінсинтазу, відповідно. За допомогою полімеразної ланцюгової реакції ізольовано та ідентифіковано ген RIB3 D. hansenii, що кодує 2,5-диаміно-4-окси-6-рибітиламінопіримідин-5’-фосфатдезаміназу. Ідентифіковано ген CKA2 (каталітична б’ субодиниця казеїнкінази 2), що супресує нездатність до надсинтезу рибофлавіну за умов дефіциту іонів заліза в середовищі. (Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь в отриманні матеріалу, експериментальній роботі та написанні статті. (Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті).
План
Основний зміст
Вывод
В результаті виконання дисертаційної роботи було ідентифіковано 6 структурних генів біосинтезу рибофлавіну дріжджів Candida famata. Ідентифіковано гени позитивного типу дії CKA2, MET2 та SEF1, що регулюють процес біосинтезу вітаміну В 2. Головні наукові та практичні результати роботи викладено у наступних висновках: 1. Отримано та біохімічно охарактеризовано колекцію реципієнтних штамів для клонування структурних генів, задіяних у біосинтезі рибофлавіну C. famata (leu2rib1, leu2rib2, leu2rib5, leu2rib6, leu2rib7).
2. Клоновано гени RIB1, RIB2, RIB5, RIB6 та RIB7 з банку генів C. famata методом функціональної гомологічної/гетерологічної комплементації, що кодують ГТФ-циклогідролазу ІІ, 2,5-диаміно-4-окси-6-рибозиламінопіримідин-5’-фосфатредуктазу, 6,7-диметил-8-рибітиллюмазинсинтазу, 3,4-дигідрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтазу та рибофлавінсинтазу, відповідно.
3. За допомогою полімеразної ланцюгової реакції ізольовано та ідентифіковано ген RIB3 D. hansenii, що кодує 2,5-диаміно-4-окси-6-рибітиламінопіримідин-5’-фосфатдезаміназу.
4. Показано здатність ідентифікованих генів біосинтезу рибофлавіну C. famata / D. hansenii комплементувати відповідні мутації у іншого виду флавіногенних дріжджів P. guilliermondii.
5. Виділено та охарактеризовано мутанти C. famata, що втратили здатність до надсинтезу рибофлавіну за умов дефіциту іонів заліза. Розроблено метод позитивної селекції для ідентифікації регуляторних генів позитивного типу дії з банку генів C. famata методом функціональної комплементації на середовищі з фторацетатом.
6. Ідентифіковано ген CKA2 (каталітична б’ субодиниця казеїнкінази 2), що супресує нездатність до надсинтезу рибофлавіну за умов дефіциту іонів заліза в середовищі.
7. Оптимізовано метод інсерційного мутагенезу для отримання мутантів та ідентифікації регуляторних генів позитивного типу дії, що контролюють флавіногенез у дріжджів C. famata.
8. Ідентифіковано гени позитивного типу дії CFMET2 (гомосерин-О-ацетилтрансфераза) та CFSEF1 (потенційний транскрипційний фактор), що залучені в регуляцію біосинтезу рибофлавіну.
Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації
1. Voronovsky A., Abbas C., Fayura L., Kshanovska B., Dmytruk K., Sibirna K., Sibirny A. Development of a transformation system for the flavinogenic yeast Candida famata. // FEMS Yeast Research. - 2002. -P. 1-8.
(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь в отриманні матеріалу, експериментальній роботі та написанні статті. Здобувач особисто здійснив конструювання банку генів флавіногенних дріжджів C. famata).
2. Dmytruk, K., Abbas, C., Voronovsky, A., Kshanovska, B., Sybirna, K., Sibirny, A. Cloning of structural genes involved in riboflavin synthesis of the yeast Candida famata // Ukr. Biokhim. Zh. - 2004. - Vol. 76. - P. 78-87.
(Дисертант опрацював дані літератури та власні результати, йому належить участь в отриманні матеріалу, експериментальній роботі та написанні статті).
(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті).
4. Abbas C., Voronovsky A., Fayura L., Kshanovska B., Dmytruk K., Sibirna K., Sibirny A. Transformation system for the flavinogenic yeast // US Patent Number US07009045, 7/03/2006.
(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів. Дисертантом особисто ізольовано з банку генів та проаналізовано фрагменти, що комплементують мутації першої та пятої біохімічних груп штамів C. famata ауксотрофів по РФ).
5. Andrii Sibirny, Kostyantyn Dmytruk, Olena Ishchuk, Oksana Chmil, Barbara Kshanovska, Andrii Voronovsky, Charles Abbas. Development of a transformation system for the flavinogenic yeast Candida famata. // 9th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, Abstracts of 9th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, Gyeongju, Korea, 2002, P. 130.
(Дисертант брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді).
6. A.Y. Voronovsky, K.V. Dmytruk, O.P. Ishchuk, C.A. Abbas, A.A. Sibirny. Cloning of structural genes involved in riboflavin synthesis of industrial flavinogenic yeast Candida famata. // 1st FEMS Congress of European Microbiologist, Abstracts of 1st FEMS Congress of European Microbiologist, Lubljana, Slovenia, 2003, P. 477.
(Дисертант брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді).
7. Andrei A. Sibirny, Kostyantyn V. Dmytruk, Olena P. Ishchuk, Andriy Y. Voronovsky, Charles A. Abbas. Cloning of structural and regulatory genes of riboflavin synthesis of industrial flavinogenic yeast Candida famata. // 21st International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Abstracts of 21st International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Gotheburg, Sweden, 2003, P. S222.
(Дисертант брав участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді. Дисертант особисто ідентифікував регуляторний ген позитивного типу дії СКА 2 C. famata, що кодує каталітичну субодиницю казеїнкінази 2).
8. Дмитрук К.В. Розробка методу інсерційного мутагенезу флавіногенних дріжджів Candida famata з метою клонування регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну // Сімнадцята наукова сесії наукового товариства ім. Шевченка. м. Львів, Україна, 2006, С. 20.
(Дисертант особисто проводив дослідження, опрацювання та аналізі експериментальних даних. Дисертант вперше ідентифікував регуляторні гени позитивного типу дії MET2, SEF1, залучені в регуляції біосинтезу РФ C. famata).
9. Дмитрук К.В. Розробка методу інсерційного мутагенезу флавіногенних дріжджів Candida famata // Конференція-конкурс молодих учених (м. Київ, Україна, 2006, С. 12).
(Дисертант проводив дослідження, опрацювання та аналізі експериментальних даних. Дисертант вперше ідентифікував регуляторні гени позитивного типу дії MET2, SEF1, залучені в регуляції біосинтезу РФ C. famata).