Пошук нових функціональних взаємодій комплексу TSC1/2 методом двогібридної системи дріжджів, а також з’ясування регуляторної ролі виявлених взаємодій в клітинах вищих евкаріотів. Створення серії кДНК-"байт"-конструкцій повнорозмірного гена Tsc2.
Аннотация к работе
З огляду на вищесказане, перспективним є вивчення білкових продуктів пухлинно-супресорних генів туберозно-склерозного комплексу TSC1 (TSC1, гамартин) і TSC2 (TSC2, туберин), які формують фізичний та функціонально активний комплекс in vivo, залучений до контролю PI3К/Akt/MTOR-залежного сигнального шляху (Bender et al., 1982; Gao et al., 2001; Kwiatkowski, 2003). На користь того, що TSC1/2 є супресором пухлин, свідчать дані мутаційного аналізу, а саме: мутації в будь-якому з двох генів TSC1 (9q34) чи TSC2 (16р13) призводять до неконтрольованої проліферації клітин і є однією з причин розвитку туберозного склерозу (TSC) - аутосомно-домінантного захворювання, для якого характерні нетипові пухлиноподібні утворення, так звані гамартоми, які виникають в широкому спектрі тканин та органів (Cheadle et al., 2000). Відомо, що комплекс TSC1/2, і туберин, зокрема, відіграє важливу роль у супресії утворення пухлин шляхом негативної регуляції PI3К-залежного сигнального шляху. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу сигнальних систем клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАНУ і виконувалась в рамках бюджетної теми №2.2.4.10 - “Дослідження структурно-функціональної організації PI3-кіназного сигнального шляху та пухлино-асоційованих антигенів” (номер державної реєстрації - 0105U005342, 2006-2010 рр.), а також у рамках співробітництва з кафедрою мікробіології та загальної імунології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та відділом біохімії та молекулярної біології Лондонського університетського коледжу (Велика Британія). Метою дисертаційної роботи був пошук нових функціональних взаємодій комплексу TSC1/2 методом двогібридної системи дріжджів, а також зясування регуляторної ролі виявлених взаємодій в клітинах вищих евкаріотів.Перевірку створених КДНК-«байт»-конструкцій на відповідність вимогам двогібридного скринування проведено за допомогою аналізу здатності химерних білків проникати до ядра та аналізу їхньої здатності самоактивувати експресію репортерних генів. Великомасштабну трансформацію дріжджових клітин КДНК-бібліотеками ембріона миші (кількість індивідуальних клонів 7,5х106) та клітин лінії HELA (кількість індивідуальних клонів 2,65х106) виробництва ORIGENE (США), проведено згідно модифікованого протоколу (Panasyuk et al., 2002) з використанням відібраної КДНК-«байт»-конструкції, що експресує LEXA/TSC2Cterm. З огляду на особливості структурної організації TSC2, було сконструйовано і використано як «байти» в дріжджовому двогібридному скринуванні конструкцію повнорозмірної форми TSC2 (LEXA/TSC2full) та ДНК-«байт»-конструкції, що містили N-та С-кінцеві ділянки TSC2 (LEXA/TSC2Cterm та LEXA/TSC2Nterm відповідно). З метою перевірки можливості використання створених ДНК-«байт»-конструкцій для скринування КДНК-бібліотек, проведено серію тестів для відбору тих конструкцій, що відповідали б таким вимогам: 1) «байт»-конструкція експресувалася з високою ефективністю у клітинах дріжджів як LEXA-злитий «байт»-білок; 2) «байт»-білок ефективно проникав до ядра; 3) «байт»-білок не спричиняв самоактивацію транскрипції репортерних генів LACZ та Leu2. Таким чином, в результаті постановки серії тестів було відібрано ДНК-«байт»-конструкцію LEXA/TSC2Cterm, що повністю відповідала вимогам двогібридної системи, і яку використовували у скринуванні КДНК-бібліотек.