Ідентифікація вірусів коротковузля, скручування листя та мармуровості винограду, оптимальний тип матеріалу та проведення діагностики. Молекулярно-біологічні методи діагностики вірусних хвороб винограду на основі аналізу і гібридизації з длРНК зондами.
Аннотация к работе
В останні роки в країні докладаються зусилля з метою відродження системи отримання винограду, вільного від цих захворювань, на основі клонів різних сортів, а також виробництва садивного матеріалу, який відповідав би показникам сертифікації. Провести оздоровлення клонів, уражених вірусами та бактеріальним раком” і № 4 “Розробити та застосувати комплекс молекулярно-біологічних та біотехнологічних методів діагностики вірусних і бактеріальних хвороб винограду з метою одержання здорового садивного матеріалу цінних сортів та клонів винограду” (номер державної реєстрації 0198U002660). Дослідження спрямовані на вирішення таких завдань: оптимізувати метод ІФА для ідентифікації вірусів коротковузля, скручування листя та мармуровості винограду; встановити оптимальний тип матеріалу та період проведення діагностики; провести тестування сортів винограду і кущів клонів на наявність латентної вірусної інфекції за допомогою імуноферментного аналізу, аналізу ДЛРНК, а також щеплення на сорти-індикатори. На підставі проведених досліджень відпрацьовано і вперше застосовано в Україні для одержання здорового матеріалу клонів винограду методи імуноферментного виявлення вірусу мармуровості та вірусу А винограду.Результати тестування сортів винограду і кущів клонів на наявність латентної вірусної інфекції методами щеплення на сорти-індикатори і імуноферментним аналізом показали, що на Півдні України найбільш розповсюдженим є вірус мармуровості, який виявлено на 7 з 9 тестованих сортів та 8 з 48 тестованих клонів прищеп. З найбільш шкідливих захворювань - коротковузля винограду виявлено на 1 з 9 тестованих сортів та на 1 з 48 клонів; скручування листя - на 4 з 9 сортів та на 2 з 48 клонів відповідно. Оптимізація ІФА і визначення оптимального матеріалу для проб показали, що найкращим матеріалом для детекції коротковузля винограду є молоді пагони, вусики і листя. Тестування неповірусів (вірус кільцевої плямистості томату, вірусу розеткової мозаїки персика і вірус мозаїки резухи) методом ІФА на садивному матеріалі винограду, інтродукованому зі США, показало відсутність цих вірусів на 68 зразках винограду. Зразки очищеної ДЛРНК, асоційованої з мозаїкою жилок, борознистістю деревини і скручуванням листя винограду були охарактеризовані за молекулярною масою.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Вывод
1. Результати тестування сортів винограду і кущів клонів на наявність латентної вірусної інфекції методами щеплення на сорти-індикатори і імуноферментним аналізом показали, що на Півдні України найбільш розповсюдженим є вірус мармуровості, який виявлено на 7 з 9 тестованих сортів та 8 з 48 тестованих клонів прищеп. З найбільш шкідливих захворювань - коротковузля винограду виявлено на 1 з 9 тестованих сортів та на 1 з 48 клонів; скручування листя - на 4 з 9 сортів та на 2 з 48 клонів відповідно. Вірус А на сортах винограду та кущах клонів прищеп не виявлений.
Кущі клонів підщеп вільні від пяти вірусів винограду, на яких проводилося тестування. Дослідження свідчать про те, що клоновий добір у сполученні із санітарною селекцією дозволяє значно знизити ураження вихідного матеріалу хворобами.
2. Оптимізація ІФА і визначення оптимального матеріалу для проб показали, що найкращим матеріалом для детекції коротковузля винограду є молоді пагони, вусики і листя.
Для виявлення вірусу мармуровості винограду найкращим матеріалом є зскрібки кортикального шару, молоді пагони і ягоди.
Вірус скручування листя краще виявляється в зскрібках кортикального шару, ягодах і листках.
Оптимальним періодом для виявлення вірусу коротковузля є кінець червня - початок липня. Вірус мармуровості найкраще виявляти на початку літа і після зниження температури восени (кінець вересня - початок жовтня).
3. Тестування неповірусів (вірус кільцевої плямистості томату, вірусу розеткової мозаїки персика і вірус мозаїки резухи) методом ІФА на садивному матеріалі винограду, інтродукованому зі США, показало відсутність цих вірусів на 68 зразках винограду. Це свідчить про санітарну безпеку інтродукції даних сортів в Україну.
4. Зразки очищеної ДЛРНК, асоційованої з мозаїкою жилок, борознистістю деревини і скручуванням листя винограду були охарактеризовані за молекулярною масою. Встановлена типова кількість ліній ДЛРНК на електрофореграмі (1 високомолекулярний компонент від 7,5 до 8,5 х 106 Д для кожного з перерахованих захворювань і 2 додаткових низькомолекулярних компоненти для мозаїки жилок винограду).
З використанням маркерів молекулярної маси перевірено 50 зразків сортів і клонів підщеп, серед яких виявлено 11, уражених вірусною інфекцією.
5. Порівняння методу аналізу ДЛРНК із методами ІФА і дот-гібридизації показало, що результати, отримані шляхом аналізу ДЛРНК, відповідають даним, отриманим методами дот-гібридизації та імуноферментного аналізу.
Метод аналізу ДЛРНК є придатним для тестування клонів підщеп у процесі отримання вихідного матеріалу клонів винограду. Проте доцільно паралельно застосовувати метод ІФА, оскільки він дозволяє ідентифікувати вірус.
6. Розроблено метод виявлення латентної вірусної інфекції винограду шляхом гібридизації з міченою ДЛРНК вірусу скручування листя винограду. Отриманий зонд дозволяє виявити скручування листя, коротковузля, борознистість деревини і мозаїку жилок винограду. Метод характеризується високою чутливістю детекції (до 1-10 нг вірусної РНК у пробі).
7. Вивчення переносників вірусної інфекції показало, що на виноградниках Одеської та Херсонської областей найбільш розповсюдженими видами нематод є X. vuitennesi та X. pachtaicum. Види - переносники вірусної інфекції, X. index i X. italiae були виявлені тільки на півдні Одеської області (Болградський та Білгород-Дністровський райони) та на супіщаних грунтах Херсонської області (район Білозерський). Встановлено видовий склад кокцид на виноградниках Одеської області, що включає види Pulvinaria vitis, Parthenolecanium corni і Pseudococcus longispinous. У досліді на вегетуючих рослинах підтверджено, що кокцида Ps.longispinus є переносником вірусу скручування листя винограду.
8. Проведене оздоровлення винограду від вірусної інфекції за допомогою термотерапії in vitro дало можливість одержати здоровий вихідний матеріал сортів Голубок, Рубін таїровский, а також селекційних форм I-55/8 і L-4-9.
9. У практиці отримання вихідного здорового матеріалу винограду рекомендується проводити тестування вихідного матеріалу винограду в умовах України із врахуванням виявлених нами закономірностей щодо часу проведення детекції окремих вірусів та типу тканин (органів), що використовуються. З огляду на ступінь розповсюдження переносників вірусів рекомендується контроль за їх наявністю та використання засобів хімічної боротьби з метою запобігання переносу вірусних хвороб винограду.
Список литературы
1. Щербина А.В. Відбір зразків для виявлення пошкодження винограду за допомогою ІФА // Захист рослин. - 2002. - №3. - С. 18.
2. Мілкус Б.Н. Дж. Ейворі, Пинська В.Н., Стицко С.А., Щербина А.В. Отримання садивного матеріалу винограду, вільного від вірусів, за допомогою термотерапії і культури тканин //Захист рослин. - 2002. - № 7. - С. 19. (Особистий внесок здобувача 50% - проведено тестування на ураження вірусами до та після термотерапії, обробка результатів).
3. Милкус Б.Н., Мулюкина Н.А., Бабенко (Щербина) А.В. Применение иммуноферментного анализа для выявления вирусов винограда //Труды научного центра виноградарства и виноделия ИВИВ “Магарач”. - 1999. - т. 1. - С.27-28. (Особистий внесок здобувача 60% - проведено тестування кущів клонів підщеп та прищеп винограду на латентне ураження вірусами).
4. Щербина А.В. Хвороба скручування листя та її діагностика // Вісник аграрної науки. - 2002. - № 8. - С. 79-80.
5. Мулюкина Н.А., Щербина А.В. Виявлення та ідентифікація вірусу мармуровості винограду // Аграрний вісник Причорноморя. - 2002. - № 18 - С. 172-176. (Особистий внесок здобувача 50% - проведено тестування кущів клонів прищеп винограду на латентне ураження вірусом мармуровості, обробка результатів).
6. Милкус Б.Н., Мулюкина Н.А., Щербина А.В. Зараженность вирусами винограда Европейских сортов из стран восточной Европы//Иммунитет и фитосанитарная селекция в системе интегрированной защиты виноградных насаждений: Тез. докл. Международной научно-практической конференции - Кишинев. - 2001. - С. 13-14. (Особистий внесок здобувача 50% - проведено тестування сортів на ураження пятьма вірусами, обробка результатів).
7. Милкус Б. Н., Мулюкина Н.А., Гайдай А.Е., Конуп Л.А., Бабенко (Щербина) А.В. Диагностика вирусных болезней винограда в Украине // Научно-технический прогресс в виноградарстве: Тез. докл. научно-практической конференции - Кишинев. - 1998. - С. 98 - 99. (Особистий внесок здобувача 50% - проведено тестування сортів і клонів винограду на латентне ураження вірусною інфекцією, обробка результатів).