Активированные кислородные метаболиты в биологических системах - Курсовая работа

Многие из этих соединений являются радикалами, то есть имеют неспаренный электрон, поэтому часто их называют свободными радикалами. Действуя совместно с другими антиоксидантами - витаминами Е и С, селен помогает улучшить мыслительные способности, снижает депрессию, прогоняет усталость [7]. антиоксидант окислительный липид биологический Чтобы объединить данные соединения в одну группу с радикалами, вводят понятие «активные формы кислорода» или «активные метаболиты кислорода», которыми обозначают ферментативные продукты активации кислорода. Первоначально все радикалы, образующиеся в живом организме, было принято делить на свободные, которые легко мигрируют в водных или липидных средах, и связанные, структурно закрепленные и участвуюшие в цепях переноса электронов. По принципу антиокислительного действия в биологических системах все антиоксиданты могут быть разделены на антиоксиданты косвенного (опосредованного) действия и антиоксиданты прямого (направленного) действия.Мы проверили 18 новых гетероциклических и селенсодержащих веществ на их возможные антиоксидантные свойства в перекисном окислении липидов. Проведя этот эксперимент, мы выяснили, что очень актуальным и целесообразнымв данный момент является синтезирование новых препаратов, способных проявлять антиоксидантные свойства, а именно - ингибировать реакции процессов перекисного окисления липидов за счет ловушек свободных радикалов кислорода.

Оглавление

Введение

Активированные кислородные метаболиты в биологических системах. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных и окислительных процессов. Перекисное окисление липидов

Активированные кислородные метаболиты. Общие сведения

Классификация АКМ

Биологическая роль АКМ

Антиоксиданты

Общие сведения

Витамин С

Каротиноиды

Витамин Е

Селен

Глутатионпероксидаза

Перекисное окисление липидов

Материалы и методы

Общие сведения

Выделение микросом печени крысы

Исследование индукции ПОЛ

Определение концентрации белка по методу Бредфорда

Результаты и обсуждение

Выводы

Список литературы

Кислород является самым распространенным химическим элементом биосферы, его соединения в состав всех живых организмов на планете. Наиболее широко представлена восстановленная форма кислорода, или вода (H2O); для высших форм жизни необычайно важен молекулярный кислород (O2), реакция восстановления которого до H2O составляет основу биоэнергетики организма человека и животных [1].

Около 90% потребляемого человеком молекулярного кислорода вовлекается в реакции окислительного фосфорилирования, вместе с тем во всех живых организмах постоянно протекают реакции с образованием активированных кислородных метаболитов (АКМ): O?2, 1O2, H2O2, HO?, OCL?, RO2 и др. Многие из этих соединений являются радикалами, то есть имеют неспаренный электрон, поэтому часто их называют свободными радикалами. Связанные радикалы, такие как компоненты цепи транспорта электронов в митохондриях, также широко представлены в клетках, однако их локализация в определенных структурах ограничивает «свободное» взаимодействие с другими молекулами [2]. По оценке Гельмута Эстербауэра, человек за 70 лет жизни потребляет 17 000 кг кислорода; за это время в организме нарабатывается 800-1700 кг кислородных радикалов. АКМ, образующиеся в процессе нормальной жизнедеятельности животной клетки, индуцируют в ДНК около 10 000 повреждений за сутки [3]. При этом генерация АКМ, очевидно, есть не эволюционная ошибка (неудача), а, напротив, - характерный физиологический процесс, результат революционного отбора [4].

Образование АКМ, известных как прооксиданты, наблюдается во многих метаболических процессах и является обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни. Функционирование и развитие клеток, и организма в целом, в кислородосодержащем окружении не могло бы быть возможным без существования защитных систем, основу которых составляет ферментативные и неферментативные антиоксиданты. Постоянное образование прооксидантов в живых организмах уравновешено их дезактивацией антиоксидантами, поэтому для поддержания гомеостаза необходима непрерывная регенерация антиоксидантной способности. Отсутствие или сбои этой непрерывности сопровождаются накоплением окислительных повреждений и приводят к возникновению окислительного стресса, который является составным элементом целого ряда патологических процессов и заболеваний, таких как воспаление, реперфузионное поражение тканей, бронхолегочные заболевания, старение, канцерогенез и др. [5][6].

Важную роль в антиоксидантной системе играет селен. Хотя сам по себе селен и не является «прямым» антиоксидантом, он принимает активнейшее участие в процессе синтеза фермента глутатионпероксидазы - мощнейшего антиоксидантного вещества, предохраняющего клеточные мембраны от разрушительного воздействия свободных радикалов. Без достаточного содержания селена этот важнейший фермент просто не будет образовываться.

В качестве антиоксиданта и детоксикатора ядовитых веществ селен защищает организм от сердечных заболеваний, усиливает иммунитет, увеличивает продолжительность жизни. Действуя совместно с другими антиоксидантами - витаминами Е и С, селен помогает улучшить мыслительные способности, снижает депрессию, прогоняет усталость [7]. антиоксидант окислительный липид биологический

Активированные кислородные метаболиты в биологических системах. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных и окислительных процессов. Перекисное окисление липидов

Активированные кислородные метаболиты. Общие сведения

АКМ - высокореакционные, преимущественно радикальные, кислородные соединения, образующиеся в живых организмах в результате неполного восстановления молекулярного кислорода или изменении спина одного из его электронов, находящихся на внешних орбиталях.

Применительно к биологическим системам понятия «свободные радикалы» и «АКМ» не совпадают - неспаренный электрон может быть локализован на атомах углерода, серы, азота; так, для живых организмов важное значение имеют тиильные радикалы глутатиона (GS?) или радикалы мочевой кислоты с локализацией электрона на атомах Sи N. С другой стороны, такие кислородсодержащие молекулы, как перекись водорода, синглетный кислород, гипогалогениты не являются радикалами, хотя и взаимодействуют с органическими молекулами через радикальные механизмы. Чтобы объединить данные соединения в одну группу с радикалами, вводят понятие «активные формы кислорода» или «активные метаболиты кислорода», которыми обозначают ферментативные продукты активации кислорода. По аналогии с активными формами кислорода иногда говорят об активных формах азота, обозначая так продукты преобразования NO-радикалов (NO?, NO , NO?, NO2, ONOOH), активных формах галогенов (HOCL, OCL?,HOBR, HOI), активных формах липидов (L?, LO?, LO2?, LOOH) [5]. В биологическом плане наиболее удачно понятие «активированные кислородные метаболиты», под которым подразумевается широкий класс кислородных соединений радикальной и нерадикальной природы.

В живых организмах существуют два принципиально разных источника АКМ: радикальные окислительные реакции и металлопротеиновые ферментативные системы. В обоих случаях молекулярный кислород выступает акцептором электронов, а появление АКМ является результатом неполного восстановления молекулы O2[7].

Классификация АКМ

Первоначально все радикалы, образующиеся в живом организме, было принято делить на свободные, которые легко мигрируют в водных или липидных средах, и связанные, структурно закрепленные и участвуюшие в цепях переноса электронов. Такое деление достаточно условно, в частности, непонятно, к свободным или связанным относятся в таком случаем убисемихинонные радикалы, которые достаточно легко перемещаются в липидных мембранах.

Введенные в последующем понятия «активные формы кислорода и азота», «активные формы хлора», «активные формы липидов» отражали желание исследователей строго определить и классифицировать весьма разнородный класс соединений, объединенных нами под общим названием активированных кислородных метаболитов (АКМ).Сегодня наиболее удачная классификация таких соединений предложена Ю. А. Владимировым[8], согласно которой все образующиеся в организме АКМ в зависимости от происхождения могут быть разделены на первичные, вторичные и третичные; среди причин появления чужеродных форм АКМ также можно выделить 3 основных фактора: радиация, оптические излучения и ксенобиотики (см. табл. 1).

Деление АКМ наприродные и чужеродные оправдано с позиций их биологической значимости. Действительно, основной функцией природных форм АКМ является регуляторная, затем защитная, в определенных ситуациях, как правило, патологических, они могут становиться токсичными и индуцировать развитие деструктивных процессов, однако такие ситуации являются исключением, а не правилом. Образующиеся при действии радиации или в процессе фотодинамической терапии чужеродные формы АКМ, также как радикалы, возникающие в процессе метаболизма ксенобиотиков, обладают выраженным цитотоксическим и деструктивным действием [7].

Таблица 1

Иногда в целях регуляторного воздействия применяются доноры NO?; попытки усилить защитные функции организма посредством индукции образования АКМ сегодня носят достаточно экзотический характер.

Первичные формы АКМ или радикалов образуются с участием специализированных молекулярных механизмов, таких как мембранные НАДФН-оксидазы (восстанавливают O2 в O2?), NO-синтазы (продуцируют NO?) или фотосенсибилизированные процессы, являющиеся основными источниками 1O2. Как правило, эти продукты ферментативного восстановления O2 или его активации, количество весьма ограничено: O2?, H2O2, OH?, NO?, 1O2. Строение и заполнение молекулярных орбиталей O2подчиняются квантовым законам, что существенно ограничивает количество образующихся продуктов. Первичные АКМ инициируют образование в реакциях свободнорадикального окисления большего числа вторичных радикалов липидов, белков, сахаров, нуклеиновых кислот, многие из которых более токсичны [8]. Деление на первичные и вторичные АКМ или радикалы вполне оправдано, так как позволяет при патологических процессах выделить главные молекулярные механизмы генерации АКМ. Однако, как и в случае с многими другими понятиями свободнорадикальной биологии, дать строгие определения первичных, вторичных и третичных радикалов сложно, так же как сложно точно определить понятие антиоксиданта [7].

Биологическая роль АКМ

Общая особенность АКМ - высокая реакционная способность и малые значения времен жизни в биологических субстратах, что делает их эффективным инструментом локального действия [9]. Так, действие OH-радикала (радиус диффузии 23 A) [10]ограничено размером средней ограниченной молекулы (например, величина молекулы пепсина - молекулярная масса 35 КДА - составляет 37 ? 74 A). Анион-радикал O2? и синглетный кислород обладают большим радиусом действия, сравнимым с размером клетки, однако уже на клеточном уровне их эффект строго локализован наличием высокоэффективного ферментативного антиоксиданта - супероксиддисмутаза (СОД), а также других антиоксидантов - таких, как витамин E, который инактивирует 1O2 посредством физического взаимодействия на расстоянии ~ 50 A [11]. Сфера влияния радикалов NO? распространяется уже на определенные клеточные структуры, такие как мышечные клетки сосудов, что вызывает их релаксацию, при этом оксид азота принципиально не отличается от гормональных мессенджеров и имеет свой «рецептор» - растворимую гуанилатциклазу. Наибольшим дальнодействием, проявляющимся на тканевом и организменном уровнях, обладают продукты радикальных реакций; так, процессы ПОЛ приводят к образованию альдегидов, эпоксидов, липидных перекисей, которые ингибируют синтез ДНК и деление клеток и в то же время индуцируют развитие опухоли. По-видимому, ПОЛ и его продукты, выступая в роли «первичного медиатора» стресса или «SOS-ответа», представляют один из наиболее ранних регуляторных механизмов, который в процессе эволюции трансформировался в ферментативную эйкозаноидную регуляцию. Окисленные фосфолипиды по свойствам сходны с фактором активации тромбоцитов и могут имитировать действие цикотина на клетки непосредственно через специфический для него рецептор.

Высокая реакционная способность АКМ делает их чрезвычайно токсичными для биологических систем на всех уровнях - от молекулярно-клеточного до организменного. В конце 40-х годов толчком для широкого изучения токсических эффектов АКМ послужили исследования действия радиации на живые организмы. В настоящее время можно утверждать, что АКМ занимают ведущее место в патогенезе радиационного поражения; деструкции тканей, вызванной развитием воспалительной реакции, и связанного с хроническим воспалением опухолеобразования; постишемических, реперфузионных и гипероксических повреждений; а также целого ряда бронхолегочных, сердечнососудистых и других заболеваний. Вместе с тем механизм патофизиологического действия АКМ во многих случаях не ясен, так как утверждение о патофизиологической роли АКМ обычно строится на двух косвенных аргументах: а) интенсивность продукции АКМ коррелируют с развитием патологического процесса; б) ингибиторы АКМ обладают защитным действием.

Открытие явления дыхательного «взрыва» в фагоцитах послужило началом широкого изучения микробицидного действия АКМ, их роли в защите организма. При этом ярко выявилось, что генетически обусловленные нарушения механизмов генерации АКМ (больные с хронических гранулематозом или дефицитом миелопероксидазы) или их ингибирование лекарственным препаратами приводит к снижению неспецифического иммунитета и является причиной либо гибели организма от инфекций, либо развития хронических патологий.

В последние годы выявлен широкий спектр физиологических эффектов АКМ, к которым прежде всего относятся регуляция клеточной пролиферации и тонуса сосудов, индукция транскрипции определенных генов [12]. Показано функционирование АКМ в качестве вторичных внутриклеточных мессенджеров. Так, АКМ непосредственно участвуют в активации онкогенов c-focи с-myc, а также гена c-jun, кодирующего главную форму фактора транскрипции AP-1, в ответ на ионизирующую радиацию [13].O2?и H2O2 активируют фактор транскрипции NF-KB, который вызывает экспрессию генов, кодирующих ряд цитокинов и вирусов, в том числе ВИЧ, а NO?подавляет активацию NF-KB, индуцируя экспрессию ингибитора фактора транскрипции IКB?И стабилизируя его. Стимуляция НАДФН-оксидазы нейтрофилов сопровождается активацией тирозинкиназ, при этом повышение накопления фосфотирозина обусловлено не только активацией АКМ фосфорилирования тирозина, но и ингибированием дефосфорилирования. В индукции синтеза белков теплового шока, повышающих резистентность клеток к высоким температурам, радиации, токсическому действию ионов тяжелых металлов и лекарственных препаратов, основная роль отводится перекиси водорода.

Выделяемая из облученных фоторецепторов H2O2 увеличивают длину и количество микроворсинок клеток пигментированного эпителия, что способствует более тесному контакту этих двух типов клеток и реализации антиоксидантных функций эпителия. NO?и CO? связываются с гемовой частью гуанилатцитклазы и обратимо изменяют синтез ЦГМФ, являясь важным компонентом внутри- и внеклеточной коммуникации. NO? участвует в посттранскрипционном контроле метаболизма железа [14].

Таким образом, образование АКМ в организме нельзя рассматривать, как существующий, но не обязательный элемент процесса жизнедеятельности.

Окислительные процессы с участием АКМ является неотъемлемым звеном существования высших форм живых организмов, негэнтропийное состояние которых поддерживается посредством снижения электронной упорядоченности молекулярного кислорода в результате его восстановления. Однако многие вопросы регуляторной функции АКМ, их взаимодействия с антиоксидантами, физиологической и патофизиологической роли сегодня все еще остаются спорными [7].

Антиоксиданты

Антиоксидант - это любое вещество, которое, присутствуя в низких по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, существенно задерживает или ингибирует его окисление [15].

По химической природе биоантиокислители представляю собой широкий класс соединений: ферменты (СОД, каталаза ГПО), фенолы и полифенолы (токоферолы, эвгенол, конидендрин, пирокатехин, производные галловой кислоты), флавоноиды (рутин, кверцетин), стероидные гормоны (лецитин, кефалин) и многие другие соединения. В зависимости от растворимости различают жирорастворимые (витамины E, A, K, стерины, убихинон) и водорастворимые (витамины С, B6, PP, серотонин, SH-содержащие соединения) биоантиокислители [16], по молекулярной массе выделяют группу низкомолекулярных антиоксидантов (глутатион, аскорбат, ?-каротин, ?-токоферол, мочевая кислота) и высокомолекулярных, не способных проникать через биологические барьеры (ферритин, каталаза, пероксидазы и др.) [17].

По принципу антиокислительного действия в биологических системах все антиоксиданты могут быть разделены на антиоксиданты косвенного (опосредованного) действия и антиоксиданты прямого (направленного) действия. Такое деление удобно при рассмотрении патологических процессов, сопровождающихся развитием окислительного стресса, в этом случае все соединения, повышающие синтез эндогенных антиоксидантов, нормализующие метаболические процессы и стабилизирующие клеточные структуры, могут быть отнесены к антиоксидантам косвенного действия. Естественно, что эффективность антиоксидантов косвенного действия проявляется только в живых системах. Соединения, непосредственного подавляющие окислительные процессы с участием АКМ invitroиinvivo можно рассматривать как антиоксиданты прямого действия. В зависимости от точки приложения действие антиоксиданта может осуществляться посредством одного или нескольких механизмов: I: ингибирование радикальных форм АКМ, способных отрывать атом водорода с образованием органических радикалов;

II: изменение структурной организации, затрудняющее окисление;

III: локальное снижение концентрации и предотвращение его включения в окисление;

IV: взаимодействие с органическими радикалами и предотвращение развития ценных окислительных процессов;

V: связывание или окисление ионов металлов переменной валентности, индуцирующих разложение перекисей и образование радикалов;

VI: перевод перекисей в стабильные продукты окисления: спирты альдегиды, кетоны.

Соединения, реализующие свой антиоксидантный эффект посредством механизмов II, III, V, VI, иногда называются превентивными антиоксидантами, в то время как пути Іи IV характерны для ингибиторов АКМ, действие которых в достаточной степени специфично [7].

По мере развития наших знаний об окислительных процессах с участием АКМ изменяется и представление об антиоксидантных механизмах защиты. До недавнего времени рассматривалась преимущественно патогенная функция АКМ, реализующаяся посредством активации процессов ПОЛ в биомембранах; при этом считалось, что как в норме, так и при патологических процессах необходимо ингибировать наработку АКМ и снижать активность ПОЛ[16]. Исследования последних лет выявили участие АКМ в регуляции тонуса сосудов, клеточной пролиферации, синтеза простагландинов, в микробицидном действии фагоцитов, в регуляции метаболических процессов в качестве внутриклеточных мессенджеров [18]. При этом поднимается вопрос о целесообразности в определенных ситуациях ингибирования наработки АКМ, что имеет важное практическое значение, так как с позиций существующих представлений сложно объяснить лечебный эффект введения перекиси водорода в низких концентрациях или аутотрансфузии УФ-облученной крови. Применение антиоксидантных витаминов (Е, С) и ?-каротина в целях профилактики заболеваний в последние годы также ставится под сомнение [7].

Необходимо отметить, что понятия «антиоксидант» и «антиоксидантная защита» имеют очень размытый характер; перефразируя Германа Мелвилла, подробная систематизация антиоксидантных соединений равносильна попытке классифицировать составляющие мирового хаоса. Так, антиоксидантами можно назвать все вещества, снижающие активность ферментативных реакций наработки АКМ (например, аллопуринол), а также многие противовоспалительные препараты, ингибирующие развитие метаболического «взрыва» в фагоцитирующих клетках. Иногда вводится понятие «вторичная антиоксидантная система», которым обозначают специализированные ферментативные механизмы устранения окислительных повреждений в клетках, такие протеиназы, фосфолипазы, экзо- и эндонуклеазы и др. Своевременное удаление поврежденных молекул повышает устойчивость клеток к токсическому действию АКМ, и поэтому с позиций биологической системы и биологической значимости радикальных окислительных процессов такие ферментативные системы могут рассматриваться как антиоксиданты[7].

Рассмотрим основные антиоксиданты и их механизм действия.

Витамин С

Аскорбиновая кислота (витамин С; ?-лактон 2,3-дегидро-L-гулоновой кислоты; 2-оксо-L-треогексо-1,4-лактон-2,3-ендиол) была впервые выделена в 1928 г. Альбертом Сент-Дьердьи. Ее биосинтез происходит главным образом из углеводов: из галактозы либо из глюкозы. Она очень нестабильна и легко разрушается при нагревании в щелочных условиях, а также под действием кислорода в присутствии ионов металлов переменной валентности, катализирующих ее окисление с образованием неактивных продуктов.

Аскорбиновая кислота - наиболее важный антиоксидант плазмы человека, где ее содержание в норме составляет 20-60 МКМ; после курса приема витамина С его уровень возрастает до 100-200 МКМ.

В биологических средах аскорбиновая кислота обладает чрезвычайно широким спектром антиоксидантных свойств; в число обезвреживаемых ею АКМ входят HOCL (что при ревматоидном артрите особенно важно для синовальной жидкости, где мала концентрация эффективного плазменного ингибитора HOCLАЛЬБУМИНА[15]), радикалы O2??, HO2?, RO2? и HO?, синглетный кислород и др.

В клетках АК может также восстанавливать тиильный (GS?) и тиопероксильный (GSO2?) радикалы глутатиона. Помимо прямого антиоксидантного действия витамин С инициирует включение железа плазмы в состав тканевого ферритина, что приводит к снижению содержания свободных ионов железа [7].

В экспериментальных исследованиях было показано, что аскорбиновая кислота может восстанавливать ?-токоферильный радикал, тем самым возвращая ?-токоферолу антиоксидантные свойства [19].

В присутствии Fe3 или Cu аскорбат становится мощным прооксидантом (также это зависит от концентрации субстрата и условий протекания окислительных реакций).В качестве стабилизатора аскорбиновый кислоты может выступать мочевая кислота, которая ингибирует радикалы аскорбата и предотвращает его окисление железом [20].

Каротиноиды

Из натуральных продуктов выделено и охарактеризовано более 600 различных каротиноидов, среди которых наиболее изученными и часто встречающимися являются ликопин, ?-, ?-, ?- каротины. Каротиноиды относятся к группе жирорастворимых растительных пигментов.

Наличие обобщенной системы ?-электронов в молекулах каротиноидов приводит к низким значениям электронно-возбужденных состояний молекул и служит причиной, что данные соединения могут легко окисляться и восстанавливаться с образованием радикалов. Показано, что каротиноиды - эффективные антиоксиданты, действующие в отношении алкоксильных и перекисных радикалов, синглетного кислорода, NO-радикалов и пероксинитрита [21].

Полиеновые углеводороды, и прежде всего каротиноиды, являются наиболее эффективными природными тушителями синглетного кислорода: константы скоростей взаимодействия основных каротиноидов с 1O2 находятся в пределах 109-1010 М-1 с-1. Константа скорости взаимодействия ?-каротина с 1O2 составляет 14 ? 109 М-1 с-1, при этом одна молекула ?-каротина вызывает конверсию 200-1000 молекул 1O2, что можно объяснить физическим механизмом тушения посредством переноса энергии на триплетный уровень ?-каротина, который находится на 22 ккал/моль ниже уровня синглетного кислорода: 1O2 ?-каротин > O2 3(?-каротин).

Такое свойство ?-каротина делает его эффективным антиоксидантом в различных фотоиндуцированных процессах, сопровождающихся образованием 1O2, вместе с тем эффективность каротинов незначительна при окислении, вызванном H2O2и ионами металлов переменной валентности. Анализ ингибирования 1O2 разными по строению соединениями каротиноидной природы показал, что эффективность ингибирования возрастает с увеличением количества сопряженных двойных С-С связей, наличие эпоксидной группы в наибольшей степени повышало эффективность по сравнению с карбонильными или гидроксильными заместителями [7]. ?-каротин может участвовать в регенерации токоферильного радикала с образованием катион-радикала ?-каротина, как это следует из реакции: ?-ТФО? H ?-каротин > ?-ТФОН ?-каротин? .

Учитывая, что ?-каротин представляет собой полиненасыщенное соединение, он сам может легко окисляться по радикальному механизму и выступать в качестве прооксиданта - индуктора свободнорадикальных реакций, особенно при увеличении его концентрации или PO2в клетках. Антиоксидантные свойства ?-каротина сильно зависят от содержания кислорода: при низких PO2 (меньше 150 мм рт. ст.) он проявляет высокую антирадикальную активность, в то время как при высоких парцеальных давлениях (? 760 мм. рт. ст.) кислорода становится прооксидантом [22].

Витамин Е

Витамин Е (?-токоферол) как жирорастворимый фактор, необходимый для размножения крыс и содержащийся в высоких концентрациях в масле из проростков пшеницы и семян салата, был открыт в 1922 г. американскими учеными Гербертом М. Эвансом и Кэтрин С. Бишоп.

Соединения, родственные витамину Е (витамеры), представляю собой группу производных хроман-6-ола (6-гидроксихромана) - токоферолов, отличающихся степенью метилирования и местоположением метильных групп в хромановом ядре [7].

Биологическое действие витамина Е преимущественно связывается с его антиоксидантными свойствами, которые в большей или меньшей степени проявляются на всех уровнях организации - от субклеточных частиц в мембранных образований до организма в целом. Впервые антиоксидантное действие ?-токоферолов было показано в 1954-м году Алом Л. Тэппелом. На сегодняшний день классическая теория антиоксидантного действия токоферолов, построенная на большом количестве экспериментальных данных по окислению жирных кислот в присутствии витамина Е, предполагает передачу атома водорода с молекулы токоферола (Тф-ОН) на пероксильный радикал (ROO?) с образованием гидроперекиси: Тф-OH ROO? > Тф-O? ROOH.

Константы скоростей реакций ?-токоферола и его витамеров с пероксильными радикалами существенно зависят от растворителя и находятся в пределах от 104 до 5 ? 108 М-1 с-1. Достаточно эффективно ?-токоферол взаимодействует с перекисными радикалами основных жирных кислот, входящих в состав клеточных мембран, константы скоростей этих реакций составили около 2,35 ? 106 М-1 с-1[23]. В модельных системах ?-токоферол эффективно взаимодействует с супероксидным анион-радикалом: константа скорости реакции O2?с ?-токоферолом - 4,9 ? 103 М-1 с-1, с его водорастворимым аналогом тролоксом - 1,7 ? 104 М-1 с-1 при 25 °C и PH 7,8 [24]. Помимо реакции с переносом атома водорода ?-Тф-OH O2? > ?-Тф-O? HO2? возможно также восстановление токофероксильного радикала при взаимодействии с O2?: ?-Тф-O? O2? > ?-Тф-O? O2 ?-Тф-O? H > ?-Тф-OH

В микросомах витамин Е одинаково эффективно ингибирует образование перекисей как в реакциях НАДФН-зависимого ПОЛ, так и при аскорбат-зависимом окислении, при этом сохраняется целостность мембранных липидов и активность ферментативных систем гидроксилирования [7].

Селен

Элементарный селен - это гомоцепной неорганический полимер с винтообразными макромолекулами, уложенными параллельно. В цепях атомы связаны ковалентно, а молекулы-цепи объединены молекулярными силами и частично - металлической связью.

Селен и его соединения используются в различных областях деятельности, в том числе в медицине и в производстве БАД. В частности, селен признан одним из важнейших антиоксидантов; этот элемент способствует детоксикации производных кислорода в организме (свободных радикалов) и играет немаловажную роль в борьбе с раком.

Важнейшей ролью селена является его вхождение в состав глутатионпероксидазы - фермента предохраняющего клетки от токсического действия перекисных радикалов.

Селен не может синтезироваться, а должен поступать с пищей извне. Следовательно, нет селена - нет глутатионпероксидазы. Имеется связь между селеном и витамином Е - они влияют на разные этапы образования органических перекисей: токоферолы подавляют (предупреждают) перекисное окисление полиненасыщенных жирных кислот, а содержащая селен глутатионпероксидаза разрушает уже образовавшиеся перекиси липидов, перекись водорода. Глутатионпероксидаза, не содержащая селен, - глутатион-S-трансфераза - разрушает только перекись водорода (как и каталаза). При достаточном поступлении в организм витамина Е проявления дефицита селена значительно нивелируются. Наибольшее количество селена содержится в белках с высоким содержанием цистина: образуются трисульфиды, которые подобно сульфгидрильным группам мембранных белков, регулируют стабильность и проницаемость мембран. При дефиците селена и снижении активности глутатионпероксидазы повышается гемолиз эритроцитов вследствие действия перекиси водорода и липоперекисей. На активность глутатионпероксидазы влияет уровень содержания витаминов С и А, которые способствуют усвоению селена, его транспорту и утилизации. Витамин Е предупреждает окисление селена, способствует его сохранению. Добавка селена при Е-дефицитном рационе тормозит накопление липоперекисей, ликвидирует или предупреждает симптомы Е-витаминной недостаточности. Восстановленныйглутатион и глутатионпероксидаза превращают липоперекиси в менее токсичные оксикислоты и этим предупреждают повреждение биоструктур. Пополнение фонда глутатиона происходит за счет аминокислот, которые содержат серу [7].

Глутатионпероксидаза

Для инактивации перекиси водорода в клетках высшых животных существует одно важное семейство ферментов - глутатионпероксидаз (систематическое название «глутатион: перекись-водорода-оксидоредуктаза»), существование которого показано Гордоном Милзом в 1957 г. В 1973 г. Джон. Т. Ротрак с соавт. установили, что в состав ГПО входит селен, и каждая молекула фермента содержала 4 атома Se.

Помимо это клеточной изоформы, получившей при дальнейшей классификации порядковый номер 1 (ГПО1), глутатионпероксидаза представлена селеновыми изоферментами - «желудочно-кишечным» (ГПО2, выделен из цитозоля клеток печени и кишечника), внеклеточным (ГПО3, выявляется в плазме и молоке), ГПО гидроперекисей фосфолипидов (ГПО4) и не содержащими Seизозимами-«секреторным» (ГПО5, обнаруживаемая в придатках яичек) и ГПО7, а также экзотический ГПО6, в состав которой селен либо входит (человек, свинья), либо не входит (мышь, крыса) [7]. Все ГПО в большей или меньшей степени катализируют реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов, включая гидропероксиды полиненасыщенных жирных кислот, в стабильные соединения - оксикислоты: 2GSH ROOH > GSSG ROH H2O

В результате взаимодействия с гидропероксидом ROOH селеноцистеиновый остаток фермента переходит из селенола в селененовую кислоту, с которой затем связывается GSHC образованием селененилсульфида: ГПО-SEH ROOH>ROH ГПО-SEOH

ГПО-SEOH GSH > H2O ГПО-Se-SG

Прореагировав со второй молекулой глутатиона, ГПО возвращается в исходное состояние: ГПО-Se-SG GSH > ГПО-SEH GSSG

ГПО способны также утилизировать H2O2: 2GSH H2O2>GSSG 2H2O

Кроме того, недавно обнаружено, что селеносодержащие ГПО проявляют пероксинитритредуктазную активность, восстанавливая ONOO? до нитрит-аниона NO2?и тем самым предотвращая опасные реакции окисления и нитрования, в которые активно вступает пероксинитрит. Стехиометрия пероксинитритредуктазной реакции аналогична классической глутатионпероксидазной реакции с участием гидропероксидов: взаимодействуя с ONOO?, фермент окисляется до селеновой кислоты и затем восстанавливается до исходного состояния двумя молекулами глутатиона; скорость реакции составляет 8 ? 106M-1c-1[25].

Также селеновые ГПО играют важную роль в регуляции биосинтеза эйкозаноидов, контролируя содержание органических перекисей и поддерживая так называемый «перекисный тонус». Так, циклооксигеназа, переводящаяарахидоновую кислоту в ЦИКЛОЭНДОГИДРОПЕРЕКИСЬPGH2, активируется гидроперекисью, высокое содержание которой приводит к самоинактивации фермента. Обычная физиологическая концентрация гидроперекисей в клетках млекопитающих составляет около 10-10 М, и ее повышение до 10-6 М вызывает активацию циклооксигеназы. Предпологается, что липоксигеназа, отвечающая за синтез лейкотриенов, простациклиновые и тромбоксановыесинтетазы, также являются объектами перекисной регуляции [26]. С этой точки зрения становится ясно, насколько важна функция ГПО в патогенезе воспалительных процессов.

Перекисное окисление липидов

На сегодняшний день все физико-химические аспекты развития процессов свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ) биологических мембран изучены достаточно хорошо. ПОЛ - вырожденно-разветвленный цепной процесс, условно разделенный на стадии: зарождение цепей, развитие цепных реакций и их разветвление, обрыв цепей. Регуляция процесса возможна на всех его стадиях - при инициировании это достигается применением ловушек свободных радикалов (фенольные антиоксиданты, токоферолы, и пр.); при разветвлении - устранением высокоактивных и часто токсичных промежуточных продуктов с помощью как низкомолекулярных антиоксидантных компонентов (например, глутатион, аскорбиновая кислота, ионы металлов переменной валентности в определенных концентрациях или их связывающие соединения и пр.), так и различные антиоксидантные ферменты (СОД, глутатионпероксидаза, каталаза и пр.). Наконец, обрыв цепи возможен с помощью дисмутации радикалов или их замены на менее реакционноспособные радикалы ингибиторов. В настоящее время описано множество природных антиоксидантов с известными свойствами, как правило, являющихся ловушками свободных радикалов.

Учитывая важность ПОЛ как в возникновении и развитии различных патологических состояний, так и в регуляции нормальных процессов жизнедеятельности организма на всех его уровнях, не утрачен интерес к разработке новых препаратов, способных тем или иным способом оказывать направленное действие на протекание ПОЛ в клетке. К новым препаратам, активным в отношении ПОЛ, прежде всего, обычно предъявляется требование ингибировать развитие реакций этого процесса в качестве ловушек свободных радикалов кислорода. Однако, в связи с многовекторностью действия различных антиоксидантных систем, можно определить ряд потенциально полезных мембранопротекторных свойств даже для нецеленаправленно получаемых новых веществ. К ним относится, во-первых, гидрофобность молекулы вещества, то есть способность его легко проникать сквозь мембрану, что позволит соединению, как минимум, проникнуть в липидный бислой, а при определенных свойствах нового вещества и стабилизировать его (так называемый структурный антиоксидант). Во-вторых, наличие фенольных структур в его составе может придать соединению свойства фенольного антиоксиданта, который обладает прямой антирадикальной активностью. В-третьих, при определенных условиях гетероциклические соединения с различными функциональными заместителями могут служить переносчиками электронов, что особенно важно при функционировании дыхательных цепей внутриклеточных мембран (митохондриальной, микросомальной и т.д.) как для регуляции, так и для нормализации их работы при утрате нормальной концентрации естественных акцепторов свободных электронов. И наконец, синтетические органические вещества, имеющие в своем составе эссенциальные микроэлементы, вероятно, при определенных условиях могут выступать в качестве транспортных форм для этих элементов, прежде всего -для Se, необходимого для функционирования одного из ключевых антиоксидатных ферментов -глутатионпероксидазы, особенно с учетом их гидрофобных свойств и низких эффективных концентраций. Однако, все эти предположения, безусловно, требуют экспериментального подтверждения.

Материалы и методы

Общие сведения

В наших исследованиях были изучены антиоксидантные свойства 18 новых гетероциклических соединений (4 из них - селеносодержащие), полученных в лаборатории органического синтеза Луганского национального педагогического университета имени Тараса Шевченко. Сначала были определены наиболее перспективные с точки зрения антиоксидантной активности соединения и установлены величины их оптимальной концентрации для простой модельной системы с лецитином яичного желтка, который служил элементарным субстратом процессов ПОЛ (этот эксперимент не входил в данную работу). Далее представлялось целесообразным изучить поведение этих веществ в опытах invitro, включающих более сложный объект - природные биологические мембраны.

В качестве подобного объекта мы использовали микросомы печени крыс, выделенные с помощью дифференциального центрифугирования мембраны эндоплазматического ретикулума, поскольку эта структура богата субстратами ПОЛ - полиненасыщенными жирными кислотами; в ее составе функционируют цепи переноса электронов, что создает условия для образования радикальных форм кислорода; многие ферменты микросом относятся к металлопротеинам, т.е. связаны с металлами переменной валентности, что также играет роль в активации ПОЛ. Использование микросом позволяет в определенной мере стандартизовать условия проведения опыта.

Постановка эксперимента заключалась в искусственном индуцировании перекисного окисления липидов мембран микросом с помощью аскорбиновой кислоты и ионов железа (СОЛЬМОРА). Добавление этих компонентов в реакционную среду способствовало образованию активированных кислородных метаболитов (гидроксильных радикалов, пероксидных радикалов жирных кислот и т.д.). После инкубации в течение 30 минут в пробах спектрофотометрически определялось количество вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида. По уровню его

1. Мы проверили 18 новых гетероциклических и селенсодержащих веществ на их возможные антиоксидантные свойства в перекисном окислении липидов. Часть соединений дали ингибирующий эффект, другие же никак не подействовали или даже проявили прооксидантные свойства.

2. Проведя этот эксперимент, мы выяснили, что очень актуальным и целесообразнымв данный момент является синтезирование новых препаратов, способных проявлять антиоксидантные свойства, а именно - ингибировать реакции процессов перекисного окисления липидов за счет ловушек свободных радикалов кислорода. Причиной актуальности является огромная роль ПОЛ в регуляторных процессах всего организма, а также развитии различных патологических состояний.

3. Особое внимание стоит уделить селенсодержащим соединениям, так как: а) Большинство из них дали сильный ингибирующий эффект;

б) Селен играет одну из самых главных ролей в антирадикальной системе человека за счет содержания в главном антиоксиданте - глутатионпероксидазе, которая без поступления этого элементаизвне не может синтезироваться.

1. Иванов К.П. Основы энергетики организма: Теоретические и практические аспекты. Том 2. Биологическое окисление и его обеспечение кислородом. - СПБ.: Наука, 1993. - c. 272.

2. ESTERBAUERH. Cytotoxicityandgenotoxicityoflipid-oxidation // Am. J. Clin. Nutr.- 1993.-Vol. 57, Suppl.- p. 779.

3. Dawson T.M., Bredt D.S., Fotuhi M. et. al. Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identicial in brain and peripheral tissues // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.- Vol. 88.- p. 779.

4. Barja G. Oxygen radicals, a failure or a success of evolution? // Free Radic. Res. Commun.- 1993.- Vol. 18.- p. 63.

5. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимическийипатофизиологическийаспекты.- M.: Наука/Интерпериодика, 2001.- c. 340.

6. Sies H. Oxidative stress. - From basic research to clinical application// Am. J. Med.- 1991.- Vol. 91, Suppl. 3C.- p.31.

7. МЕНЬЩИКОВАЕ. Б., ЛАНКИНВ. З., ЗЕНКОВН. К., БОНДАРЬИ. А., КРУГОВЫХН. Ф., ТРУФАКИНВ. А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. - М., 2006. - стр. 12-13, 21-22, 141-143, 193-196, 228-231, 383, 389-390

8. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Сорос.образоват. журн.- 2000.- № 12.- c. 13.

9. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Успехи соврем.биологии.- 1993.- Т. 113, вып.3.- c. 286.

10. Vanasbeck B.S. Involvment of oxygen radicals and blood cells in the pathogenesis of ARDS by endotoxin and hyperoxia // Appl. Cardiopulm. Pathophysiol.- 1991.- Vol. 4.- p. 127.

11. Dimascio P., Devasagayam T.P.A., Raiser S., Sies H. Carotenoids, tocopherols, and thiols as biological singlet molecular oxygen quenchers // Biochem. Soc. Trans.- 1990.- Vol. 18.- p. 1054-1056.

12. Li J. M., Shah A.M., Endothelial cell superoxide generation: regulation and relevance for cardiovascular pathophysiology // Am. J.Physiol. Regul. Comp. Physiol.- 2004.- Vol. 287.- p. 1014.

13. Poli G., Leonarduzzi G., Biasi F., Chiarpotto E. Oxidative stress and cell signaling // Current Med. Chem.- 2004.- Vol. 11.- p. 1163.

14. Landar A., Darley-Usmar V.M. Nitric oxide and cell signaling; modulation of redox tone and protein modification // Amino Acids.- 2003.- Vol. 25.- p. 313.

15. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine (2nded.).- Oxford: Clarendon, 1989.-p. 320, 433.

16. Абрамова Ж. И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества.- Л.: Наука, 1985.- с. 80.

17. Кения М. В., Лукаш А. И., Гуськов Е. П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе // Успехи соврем.биологии.- 1993.- Т. 113, вып. 4.- с. 456.

18. Cross A. R., Jones O. T. G. Enzymic mechanisms of superoxide production // Biochim. Biophys.Acta.- 1991.- Vol. 1057.- p. 281.

19. Nikki E. Action of ascorbic acid as a scavenger of active and stable oxygen radicals // Am. J. Klin. Nutr.- 1991.- Vol. 54.- p. 1119.

20. Sevanian A., Davies K. J. A., Hochstein P. Serum urate as an antioxidant for ascorbic acid // Am. J. Klin. Nutr.- 1991.- Vol. 54.-p. 1129.

21. Kikugawa K. Hiramoto K. Tomiyama S. Asano Y. ?-Carotene effectively scavenges toxic nitrogen oxides; nitrogen dioxide and peroxynitrous acis // Febs Lett.- 1997.- Vol. 404.- p. 175.

22. Lowe G. M., Vlismas Л., Young A. J. Carotenoids as prooxidants? // Mol Aspects Med.- 2003. Vol. 24.- p.363-364.

23. Azzi A., Stocker A. Vitamin E: non-antioxidant roles // Progr. LIPIDRES.- 2000.- Vol. 39.- p. 231.

24. Gotoh N., Niki E. Rates of interactions of superoxide with vitamin E, vitamin C and relates compounds as measured by chemiluminescence // Biochim. Biophys.Acia.- 1992.- Vol. 1115.- p. 201.

25. Briviba K., Kissner R., Koppenol W. H., Sies H. Kinetic study of the reaction of glutathione peroxidase with peroxynitrite // Chem. Res. Toxicol.- 1998.- Vol. 11.- p. 1398-1399.

26. Link E. M. Enzymic pathways involved in cell response to H2O2 // Free Radic. Res. Commun.- 1990.- Vol. 11.- p. 89.

27. Зенков Н. К., Кандалинцева Н. В., Ланкин В. З., Меньщикова Е. Б. Фенольные биоантиоксиданты - Новосибирск, 2003.- с. 120.

Размещено на .ru